Флуоресцентная визуализация - Fluorescence imaging

Многоцветное флуоресцентное изображение живых клеток HeLa

Флуоресцентная визуализация это тип неинвазивной техники визуализации, которая помогает визуализировать биологические процессы происходящие в живом организме. Изображения могут быть получены различными способами, включая: микроскопия, зонды для визуализации и спектроскопия.

Флуоресценция сам по себе является формой свечение который возникает из-за того, что вещество излучает свет определенной длины волны после поглощения электромагнитное излучение. Молекулы, которые повторно излучают свет при поглощении света, называются флуорофоры.^[1]^[2]

Флуоресцентная визуализация позволяет сфотографировать флуоресцентные красители и флуоресцентные белки, чтобы отметить молекулярные механизмы и структуры. Это позволяет экспериментально наблюдать динамику экспрессия гена, экспрессия белков и молекулярные взаимодействия в живой клетке.^[3] По сути, он служит точным количественным инструментом для биохимических применений.

Распространенное заблуждение, флуоресценция отличается от биолюминесценция тем, как белки из каждого процесса производят свет. Биолюминесценция - это химический процесс, при котором ферменты расщепляют субстрат для получения света. Флуоресценция - это физическое возбуждение электрона и последующее возвращение к излучению света.

Атрибуты

Механизм флуоресценции

Диаграмма, показывающая связь между поглощением и флуоресценцией

Когда определенная молекула поглощает свет, энергия молекулы ненадолго повышается до более высокого возбужденного состояния. Последующее возвращение в основное состояние приводит к испусканию флуоресцентного света, который можно обнаружить и измерить. Излучаемый свет, возникающий в результате поглощения фотона энергии hv, имеет определенную длину волны. Важно знать эту длину волны заранее, чтобы во время эксперимента измерительное устройство знало, какая длина волны должна быть установлена для обнаружения светового излучения. Эта длина волны определяется уравнением:

${ displaystyle lambda _ {выбросы} = { frac {hc} {{энергия} _ {выбросы}}}}$

Где час = Постоянная Планка, и c = скорость света. Обычно здесь используется большое сканирующее устройство или ПЗС-матрица для измерения интенсивности и цифрового фотографирования изображения.^[1]

Флуоресцентные красители против белков

Флуоресцентные красители, не имеющие времени созревания, обладают более высокой фотостабильностью и яркостью по сравнению с флуоресцентными белками. Что касается яркости, яркость зависит от коэффициента экстинкции флуорофоров или способности поглощать свет, а также от его квантовой эффективности или эффективности преобразования поглощенного света в люминесцентное свечение. Сами красители не очень флуоресцируют, но когда они связываются с белками, их легче обнаружить. Один из примеров, NanoOrange, связывается с оболочкой и гидрофобными областями белка, будучи невосприимчивым к восстанавливающим агентам. Что касается белков, эти молекулы сами будут флуоресцировать, когда они поглощают определенную длину волны падающего света. Один из примеров этого, зеленый флуоресцентный белок (GFP), флуоресцирует зеленым при воздействии света в диапазоне от синего до УФ. Флуоресцентные белки - отличные репортерные молекулы, которые могут помочь в локализации белков, наблюдении за связыванием белков и количественной оценке экспрессии генов.^[1]

Диапазон изображения

Поскольку некоторые длины волн флуоресценции находятся за пределами диапазона человеческого глаза, для точного обнаружения света и отображения излучения используются устройства с зарядовой связью (ПЗС). Обычно это происходит в диапазоне 300-800 нм. Одним из преимуществ флуоресцентной передачи сигналов является то, что интенсивность излучаемого света довольно линейно зависит от количества предоставленных флуоресцентных молекул. Очевидно, это зависит от того, что интенсивность и длина волны поглощенного света постоянны. Что касается самого изображения, оно обычно имеет 12-битный или 16-битный формат данных.^[1]

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) освещается УФ-светом у трех лабораторных мышей

Системы визуализации

Основными компонентами систем флуоресцентной визуализации являются:

Источник возбуждения - устройство, которое производит либо источник с широкой длиной волны, например УФ-свет, либо источник с узкой длиной волны, такой как лазер.
Световая оптика дисплея - механизм, свет которого освещает образец. Обычно это делается путем прямого освещения образца.
Световая ассортиментная оптика - метод сбора самого света. Обычно это линзы, зеркала и фильтры.
Фильтрация излучаемого света - оптические фильтры гарантируют, что отраженный и рассеянный свет не будет включен в флуоресценцию. Три класса эмиссионных фильтров: длиннопроходные, короткочастотные и полосовые.
Обнаружение, усиление и визуализация - фотоумножитель (ФЭУ) или устройство с зарядовой связью (ПЗС) используются для обнаружения и количественного определения испускаемых протонов.

Приложения

В ПЦР (электрофорез в агарозном геле) SYBR Green - очень распространенный краситель, который связывается с ДНК и используется для визуализации полос ДНК в агарозном геле. Краситель поглощает синий свет и флуоресцирует зеленым светом, чтобы система визуализации могла его уловить.
Блоттинг (Вестерн, Нозерн и Саузерн) - флуорохромы могут связываться с антителами, РНК и ДНК для флуоресценции и количественной оценки данных
Секвенирование ДНК - секвенирование по Сэнгеру - это распространенная форма обнаружения нуклеиновых кислот, которая может использовать флуоресцентно меченые ддНТФ для изображения пиков флуоресценции.
Хирургия под контролем флуоресцентного изображения - это метод медицинской визуализации, при котором флуоресцентная метка массы помогает в навигации. Например, индоцианин зеленый можно использовать для обнаружения лимфатических узлов у онкологических больных.^[4]
Флуоресцентная визуализация с точностью до одного нанометра (FIONA) - использует освещение полного внутреннего отражения для уменьшения шума и увеличения яркости флуорофоров
Визуализация кальция - метод, использующий флуоресцентные молекулы, называемые индикаторами кальция, которые изменяют флуоресценцию при связывании с кальцием.²⁺ ионы. Это ключевая часть наблюдения за активностью клеток нервной системы.^[5]

Агарозный гель с использованием бромистого этидия в качестве флуоресцентной метки при УФ-освещении

Виды микроскопии

Для изменения визуализации и контрастности изображения можно использовать другой набор микроскопических методов. У каждого метода есть свои плюсы и минусы, но все они используют один и тот же механизм флуоресценции для наблюдения за биологическим процессом.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения - это метод микроскопии, в котором используются затухающие волны для выборочного наблюдения флуоресценции отдельной молекулы.^[6]
Флуоресцентная микроскопия светового листа - это метод флуоресцентной микроскопии, который освещает тонкий срез образца под перпендикулярным углом исследования.^[7]
Визуализирующая микроскопия за время жизни флуоресценции - это метод визуализации, при котором регистрируются изменения флуоресценции с течением времени.

Преимущества

Неинвазивная визуализация in vivo может происходить без прокола кожи
Чувствительные зонды разработаны так, чтобы быть чрезвычайно чувствительными к обнаружению биологических молекул, таких как ДНК, РНК и белки.^[1]
Мульти-маркировка - в образцах можно обнаружить несколько флуорохромов, что упрощает интеграцию стандартов и контроля.
Стабильность меченых молекул - флуоресцентно меченые молекулы, используемые при визуализации, могут храниться в течение месяцев, в то время как другие молекулы, подобные тем, которые радиоактивно мечены, будут распадаться в течение нескольких дней.^[7]
Относительно безопасно в обращении - с большинством флуорофоров можно безопасно и в достаточной степени обращаться в перчатках, в то время как, например, для радиоизотопов могут потребоваться свинцовые экраны или другая радиационная защита.^[7]
Простая утилизация - многие флуорофоры требуют минимальных методов утилизации, в то время как радиоактивные отходы требуют регулируемого захоронения и длительного обращения. Это также помогает снизить затраты, необходимые для использования этих продуктов.

Пример флуоресцентного микроскопа с устройством с заряженной связью (ПЗС) для захвата изображений

Недостатки

Фотообесцвечивание - это распространенная проблема флуорофоров, когда постоянное переключение между основным и возбужденным состоянием повреждает молекулу и снижает ее интенсивность.^[7]
Восприимчивость к окружающей среде - факторы окружающей среды, такие как температура, концентрация ионов и pH, могут влиять на эффективность и излучение флуорохромов.
Токсичность - некоторые флуорохромы могут быть токсичными для клеток, тканей, in vivo, или производя мутации.^[8]
Ограниченная разрешающая способность - флуоресцентные микроскопы ограничены в своей способности различать близкие объекты на макроскопическом уровне. Для сравнения, электронные микроскопы, например, имеют способность разрешать в гораздо меньшем диапазоне.
Ограниченный начальный диапазон светимости - интенсивность падающего источника света имеет предел, выход за пределы которого может привести к фотодеструкции молекул.^[1]

В целом, эта форма визуализации чрезвычайно полезна в передовых исследованиях, поскольку позволяет отслеживать биологические процессы. Переход от двухмерных флуоресцентных изображений к трехмерным позволил ученым лучше изучать пространственную точность и разрешение. Кроме того, сосредоточив усилия на четырехмерном анализе, ученые теперь могут контролировать клетку в режиме реального времени, что позволяет им отслеживать быстро протекающие процессы.

Будущие направления

Различные цвета флуоресценции из диапазона флуоресцентных белков

Разработка более эффективных флуоресцентных белков - задача, которую взяли на себя многие ученые, чтобы улучшить возможности зонда для визуализации. Часто мутации в определенных остатках могут значительно изменить флуоресцентные свойства белка. Например, за счет мутации гена F64L в GFP медузы белок может более эффективно флуоресцировать при 37 ° C, что является важным свойством при выращивании культур в лаборатории.^[9] В дополнение к этому, генная инженерия может производить белок, который излучает свет с лучшей длиной волны или частотой.^[9] Кроме того, решающую роль может сыграть сама окружающая среда. Время жизни флуоресценции можно стабилизировать в полярной среде.

Механизмы, которые были хорошо описаны, но не обязательно включены в практические приложения, имеют многообещающий потенциал для флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - чрезвычайно чувствительный механизм, который производит сигнальные молекулы в диапазоне 1-10 нм.^[6]

Улучшения в методах, составляющих процессы флуоресценции, также имеют решающее значение для более эффективных дизайнов. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) - это метод анализа, который отслеживает колебания интенсивности флуоресценции. Этот анализ является составной частью многих устройств для получения флуоресцентных изображений, и улучшение пространственного разрешения может улучшить чувствительность и диапазон.^[6]

Разработка более чувствительных зондов и аналитических методов лазерно-индуцированной флуоресценции может позволить получить более точные и современные экспериментальные данные.