Характеристика липидного бислоя - Lipid bilayer characterization

Характеристика липидного бислоя использование различных оптических, химических и физических методов зондирования для изучения свойств липидных бислоев. Многие из этих методов сложны и требуют дорогостоящего оборудования из-за фундаментальной природы липидный бислой делает эту структуру очень сложной для изучения. Отдельный бислой, поскольку он имеет толщину всего несколько нанометров, невидим в традиционной световой микроскопии. Двухслойный слой также является относительно хрупкой структурой, поскольку он полностью удерживается нековалентный связывает и необратимо разрушается при удалении из воды. Несмотря на эти ограничения, за последние семьдесят лет были разработаны десятки методов, позволяющих исследовать структуру и функцию бислоев. Первый общий подход заключался в использовании неразрушающего на месте такие измерения, как дифракция рентгеновских лучей и электрическое сопротивление, которое измеряет свойства бислоя, но не отображает его на самом деле. Позже были разработаны протоколы для модификации бислоя и обеспечения его прямой визуализации сначала в электронный микроскоп а в последнее время с флуоресцентная микроскопия. За последние два десятилетия появилось новое поколение инструментов описания, включая AFM позволил прямое зондирование и визуализацию мембран на месте практически без химических или физических изменений. В последнее время, двойная поляризационная интерферометрия был использован для измерения оптических двулучепреломление липидных бислоев, чтобы охарактеризовать порядок и нарушения, связанные с взаимодействиями или воздействием окружающей среды.

Флуоресцентная микроскопия

Человеческие эритроциты под микроскопом. В клеточная мембрана окрашен флуоресцентным красителем. Шкала 20 мкм.

Флуоресцентная микроскопия это метод, с помощью которого определенные молекулы могут быть возбуждены с помощью одной длины волны света и будут излучать другую более длинную длину волны света. Поскольку каждая флуоресцентная молекула имеет уникальный спектр поглощение и выброс можно определить расположение определенных типов молекул. Природные липиды не флуоресцируют, поэтому всегда необходимо включать молекулу красителя для изучения липидных бислоев с помощью флуоресцентной микроскопии. В некоторой степени добавление молекулы красителя всегда изменяет систему, и в некоторых случаях может быть трудно сказать, вызван ли наблюдаемый эффект липидами, красителем или, чаще всего, их комбинацией. Краситель обычно присоединяется либо к липиду, либо к молекуле, которая очень похожа на липид, но, поскольку домен красителя относительно велик, он может изменить поведение этой другой молекулы. Это особенно спорный вопрос при изучении распространение или разделение фаз липидов, поскольку оба процесса очень чувствительны к размеру и форме участвующих молекул.

Это потенциальное осложнение было выдвинуто против использования одного из восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) для определения коэффициентов двухслойной диффузии. В типичном эксперименте FRAP небольшая (~ 30 мкм в диаметре) область составляет фотообесцвеченный под воздействием интенсивного источника света. Затем эта область контролируется с течением времени, поскольку «мертвые» молекулы красителя диффундируют и заменяются целыми молекулами красителя из окружающего бислоя. Подбирая эту кривую восстановления, можно рассчитать коэффициент диффузии бислоя.[1][2] Аргументом против использования этого метода является то, что на самом деле изучается диффузия красителя, а не липида.[3] Это различие, хотя и верно, не всегда важно, поскольку подвижность красителя часто определяется подвижностью бислоя.

В традиционной флуоресцентной микроскопии разрешение ограничено примерно половиной длины волны используемого света. За счет использования конфокальная микроскопия и при обработке изображений этот предел может быть расширен, но обычно не намного ниже 100 нанометров, что намного меньше, чем типичная клетка, но намного больше, чем толщина липидного бислоя. Совсем недавно передовые методы микроскопии при определенных обстоятельствах позволили получить гораздо большее разрешение, вплоть до субнм. Одним из первых разработанных методов был Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET). В FRET две молекулы красителя выбираются таким образом, чтобы спектр излучения одной перекрывал спектр поглощения другой. Эта передача энергии чрезвычайно зависит от расстояния, поэтому с разрешением по Ангстрему можно определить, насколько далеко друг от друга находятся два красителя. Это можно использовать, например, чтобы определить, когда два бислоя предохранитель и их компоненты смешиваются.[4] Другой метод микроскопии высокого разрешения - флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия (ФЛИК). Этот метод требует, чтобы образец был установлен на отражающей поверхности, подвергшейся точно микромеханической обработке. Изучая деструктивное вмешательство Благодаря сформированным узорам можно индивидуально разделить две створки поддерживаемого бислоя и определить распределение флуоресцентного красителя в каждой.[5]

Электрические

Патч зажим записи изменений проводимости, связанных с открытием и закрытием ионный канал.

Электрические измерения - это наиболее простой способ охарактеризовать одну из наиболее важных функций бислоя, а именно его способность разделять и предотвращать поток ионов в растворе. Соответственно, определение электрических характеристик было одним из первых инструментов, используемых для изучения свойств модельных систем, таких как черные мембраны. Уже было известно, что клеточная мембрана способна поддерживать ионный градиент, и что этот градиент отвечает за способность нейроны посылать сигналы через потенциал действия. Демонстрация того, что аналогичные явления могут быть воспроизведены in vitro была важной проверкой полезности модельных систем.[6]

По сути, все электрические измерения бислоев включают размещение электрода по обе стороны от мембраны. Применяя смещение к этим электродам и измеряя результирующий ток, можно определить сопротивление бислоя. Это сопротивление обычно довольно велико для неповрежденных бислоев, часто превышая 100 ГОм, поскольку гидрофобное ядро ​​непроницаемо для заряженных гидратированных частиц. Поскольку это сопротивление настолько велико, наличие даже нескольких отверстий нанометрового размера приводит к резкому увеличению тока и может быть легко определено.[7] Чувствительность этой системы такова, что даже активность отдельных ионные каналы можно решить.[8] В таких измерениях постоянного тока необходимо использовать электрохимически активные электроды, чтобы обеспечить необходимые положительные заряды с одной стороны и отрицательные заряды с другой. Самая распространенная система - это серебро / хлорид серебра электрод, поскольку эта реакция является стабильной, обратимой, включает перенос одного электрона и может производить большие токи.[9] В дополнение к простым измерениям постоянного тока также можно выполнять электрические характеристики переменного тока для извлечения информации о емкости и сложных сопротивление бислоя. Поскольку емкость обратно пропорциональна толщине, а бислои очень тонкие, они обычно имеют очень большую емкость, порядка 2 мкФ / см.2. Измерения емкости особенно полезны при работе с черными липидными мембранами, поскольку их можно использовать для определения того, когда растворитель / липидная пробка утончается до одного бислоя.

Оптический

Липиды очень полярные молекулы которые при самостоятельной сборке в бислои создают сильно двулучепреломляющий слой[10] где параллельные оптические свойства сильно отличаются от свойств перпендикуляра. Этот эффект, изученный двойная поляризационная интерферометрия был использован для измерения динамической реорганизации слоя из-за температуры, ионной силы и молекулярных взаимодействий, например, с антимикробные пептиды.

Гидратированные бислои демонстрируют богатую колебательную динамику и являются хорошей средой для эффективной передачи колебательной энергии. Колебательные свойства липидных монослоев и бислоев исследованы сверхбыстрыми спектроскопическими методами.[11] и недавно разработанные вычислительные методы.[12]

AFM

Иллюстрация типичного AFM сканирование поддерживаемого липидного бислоя. Ямки - это дефекты в бислое, обнажающие гладкую поверхность подложки под ним.

Атомно-силовая микроскопия (AFM) использовался в последние годы для визуализации и исследования физических свойств липидных бислоев. АСМ - многообещающий метод, поскольку он позволяет получать изображения с нанометровым разрешением при комнатной температуре и даже под водой, в условиях, необходимых для естественного поведения бислоя. Эти возможности позволили получить прямое изображение тонкого волнового фазового перехода в поддерживаемом бислое.[13] Другой эксперимент АСМ, проведенный в режим нажатия в водной буферной среде позволили (1) определить образование трансмембранных пор (отверстий) вокруг наночастиц диаметром приблизительно от 1,2 до 22 нм путем вычитания изображений АСМ из серий, записанных во время образования липидного бислоя, и (2) наблюдать адсорбцию одного инсулина молекулы на экспонированные наночастицы.[14] Еще одно преимущество состоит в том, что AFM не требует флуоресцентного или изотопический маркировка липидов, поскольку наконечник зонда механически взаимодействует с двухслойной поверхностью. Из-за этого одно и то же сканирование может выявить информацию как о бислое, так и о любых связанных с ним структурах, даже до степени разрешения отдельных мембранных белков.[15] Помимо визуализации, АСМ может также исследовать механическую природу небольших хрупких структур, таких как липидные бислои. Одно исследование продемонстрировало возможность измерения модуля упругости отдельных наноразмерных мембран, подвешенных на пористом анодном оксиде алюминия.[16]

Хотя AFM является мощным и универсальным инструментом для изучения липидных бислоев, существуют некоторые практические ограничения и трудности. Из-за хрупкой природы бислоя чрезвычайно низкие усилия сканирования (обычно 50 пН или меньше[13][17]) необходимо использовать во избежание повреждений. Это соображение особенно важно при изучении метастабильных систем, таких как везикулы, адсорбированные на подложке, поскольку наконечник АСМ может вызывать разрыв и другие структурные изменения.[18] Также необходимо соблюдать осторожность при выборе подходящего материала и подготовки поверхности для наконечника АСМ, поскольку гидрофобные поверхности могут сильно взаимодействовать с липидами и нарушать двухслойную структуру.[19]

Электронная микроскопия

Изображение липидного пузырька с просвечивающего электронного микроскопа. Две темные полосы по краю - это две листочки бислоя. Подобные электронные микрофотографии подтвердили двухслойную природу клеточной мембраны в 1950-х годах.

В электронная микроскопия луч сфокусированного электроны взаимодействует с образцом, а не с лучом света, как в традиционной микроскопии. Электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет, поэтому электронная микроскопия имеет гораздо более высокое разрешение, чем световая микроскопия, потенциально вплоть до атомного масштаба. Поскольку липидные бислои организованы на молекулярном уровне, это более высокое разрешение было бесценным. В 1960 году, когда еще продолжались споры о структуре бислоя, именно электронная микроскопия предложила первую прямую визуализацию двух соприкасающихся створок.[20] В сочетании с методами быстрого замораживания электронная микроскопия также использовалась для изучения механизмов меж- и внутриклеточного транспорта, например, для демонстрации того, что экзоцитозный везикулы являются средством выделения химических веществ при синапсы.[21] Часто электронная микроскопия является единственным методом зонда с достаточным разрешением для определения сложных морфологий нанометрового масштаба.

Ограничения электронной микроскопии при изучении липидных структур связаны, прежде всего, с пробоподготовкой. Большинство электронных микроскопов требуют, чтобы образец находился в вакууме, что несовместимо с гидратацией при комнатной температуре. Чтобы решить эту проблему, образцы могут быть отображены под криогенный условия с замороженной связанной водой, или металлический негатив можно сделать из замороженного образца. Также обычно необходимо окрашивать бислой соединением тяжелого металла, таким как тетроксид осмия или уранилацетат, поскольку компоненты липидов с низким атомным весом (углерод, азот, фосфор и т. Д.) Имеют небольшой контраст по сравнению с водой. Если Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ), также необходимо разрезать или отполировать образец до очень тонкого (<1 микрометра) листа, что может быть трудным и требовать много времени. Сканирующая электронная микроскопия (SEM) не требует этого шага, но не может предложить то же разрешение, что и TEM. Оба метода являются поверхностно-чувствительными и не могут выявить информацию о глубоко заглубленных структурах.

Рассеяние нейтронов и рентгеновских лучей

Дальнейшая информация: Рассеяние нейтронов, Методы рассеяния рентгеновских лучей, и Нейтронная рефлектометрия

И рентгеновские лучи, и нейтроны высоких энергий используются для исследования структуры и периодичности биологических структур, включая бислои, потому что они могут быть настроены для взаимодействия с веществом на соответствующих масштабах длины (ангстрем-нм). Часто эти два класса экспериментов предоставляют дополнительную информацию, поскольку каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Рентгеновские лучи слабо взаимодействуют с водой, поэтому объемные образцы можно исследовать с относительно простой подготовкой образцов. Это одна из причин, по которой рассеяние рентгеновских лучей было методом, впервые использованным для систематического изучения межслойного расстояния.[22] Рассеяние рентгеновских лучей также может дать информацию о среднем расстоянии между отдельными липид молекул, что привело к его использованию для характеристики фазовые переходы.[23] Одним из ограничений рентгеновских методов является то, что рентгеновские лучи относительно нечувствительны к легким элементам, таким как водород. Этот эффект является следствием того факта, что рентгеновские лучи взаимодействуют с веществом путем рассеяния электронной плотности, которая уменьшается с уменьшением атомного номера. Напротив, нейтроны рассеиваются за пределами ядерной плотности и ядерных магнитных полей, поэтому чувствительность не уменьшается монотонно с z. Этот механизм также обеспечивает в некоторых случаях сильный изотопный контраст, особенно между водородом и дейтерий, что позволяет исследователям настраивать экспериментальный базовый уровень путем смешивания воды и дейтерированной воды. Использование рефлектометрии вместо рассеяния нейтронами или рентгеновскими лучами позволяет экспериментаторам исследовать поддерживаемые двухслойные или многослойные стопки. Эти измерения более сложны для анализа, но позволяют определить состав поперечного сечения, включая расположение и концентрацию воды в бислое.[24] В случае измерений как нейтронного, так и рентгеновского рассеяния, предоставленная информация является усредненным по ансамблю системой и, следовательно, подвержена неопределенности, основанной на тепловых флуктуациях в этих высокомобильных структурах.[25]

использованная литература

  1. ^ Д. Аксельрод, Д. Э. Коппель, Дж. Шлессинджер, Э. Элсон и У. У. Уэбб. «Измерение подвижности путем анализа кинетики восстановления флуоресцентного фотообесцвечивания». Биофизический журнал. 16. (1976) 1055-69.
  2. ^ Супасис Д. М. «Теоретический анализ экспериментов по восстановлению флуоресцентного фотообесцвечивания». Биофизический журнал. 41. (1983) 95-7.
  3. ^ В. Л. Ваз и П. Ф. Алмейда. "Микроскопическая диффузия в сравнении с макроскопической в ​​однокомпонентных жидкофазных липидных двухслойных мембранах". Биофизический журнал. 60. (1991) 1553-1554.
  4. ^ Л. Гохуа и Р. С. Макдональд. «Слияние липидных двухслойных везикул: промежуточные соединения, полученные с помощью высокоскоростной микрофлуоресцентной спектроскопии». Биофизический журнал. 85. (2003) 1585-1599.
  5. ^ Дж. М. Крейн, В. Кисслинг и Л. К. Тамм «Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоях с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюра. 21. (2005) 1377-1388.
  6. ^ П. Мюллер, Д. О. Рудин, Х. И. Тьен и У. К. Уэскотт. «Восстановление структуры клеточной мембраны in vitro и ее превращение в возбудимую систему». Природа. 194. (1962) 979-980.
  7. ^ Меликов К.С., Фролов В.А., Щербаков А.В., Самсонов А.В., Чизмаджев Ю.А., Черномордик Л.В. "Индуцированные напряжением непроводящие препоры и метастабильные одиночные поры в немодифицированном плоском липидном бислое" Биофизический журнал. 80. (2001) 1829-1836.
  8. ^ Э. Нехер и Б. Сакманн. "Одноканальные токи, записанные с мембраны денервированных мышечных волокон лягушки" Природа. 286. (1976) 71-73.
  9. ^ Д. Т. Сойер, "Электрохимия для химиков". 2-е изд. 1995: Wiley Interscience.
  10. ^ Алиреза Машаги и др. Оптическая анизотропия поддерживаемых липидных структур, исследованная с помощью волноводной спектроскопии, и ее применение для изучения кинетики образования поддерживаемого липидного бислоя Anal. Chem., 80 (10), 3666–3676 (2008)
  11. ^ М. Бонн и др., Структурная неоднородность межфазной воды в липидных монослоях, обнаруженная с помощью спектроскопии поверхностно-специфических вибрационных насос-зонд, J. Am. Chem. Soc. 132, 14971–14978 (2010).
  12. ^ Миша Бонн и др., Межфазная вода способствует передаче энергии, вызывая расширенные колебания в липидах мембран, J Phys Chem, 2012 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp302478a
  13. ^ а б Т. Каасгаард, К. Лейди, Дж. Х. Кроу, О. Э. Моуритсен и К. Йоргенсен. «Температурно-контролируемая структура и кинетика фаз пульсации в одно- и двухкомпонентных поддерживаемых липидных бислоях» Биофизический журнал. 85. (2003) 350-360.
  14. ^ Ю. Ройтер, М. Орнатска, А. Р. Раммохан, Дж. Балакришнан, Д. Р. Гейне, С. Минько, Взаимодействие наночастиц с липидной мембраной., Nano Letters, т. 8, вып. 3. С. 941-944 (2008).
  15. ^ Р. П. Рихтер и А. Бриссон "Характеристика липидных бислоев и белковых ансамблей, поддерживаемых на шероховатых поверхностях, с помощью атомно-силовой микроскопии". Ленгмюра. 19. (2003) 1632-1640.
  16. ^ С. Стелтенкамп, М. М. Мюллер, М. Дезерно, К. Хеннесталь, К. Стейнем и А. Яншофф «Механические свойства пронизывающих поры липидных бислоев, исследованные с помощью атомно-силовой микроскопии». Биофизический журнал. 91. (2006) 217-226.
  17. ^ С. В. Хуэй, Р. Вишванатан, Дж. А. Засадзински и Дж. Н. Израэлачвили. «Структура и стабильность фосфолипидных бислоев с помощью атомно-силовой микроскопии». Биофизический журнал. 68. (1995) 171-8.
  18. ^ К. Димитриевский, М. Зак, В. П. Жаданов и Б. Касемо. «Визуализация и манипулирование адсорбированными липидными пузырьками с помощью наконечника АСМ: эксперимент и моделирование методом Монте-Карло». Коллоиды и поверхности Б. 47. (2006) 115-125.
  19. ^ Дж. Шнайдер, В. Баргер и Г. У. Ли. «Свойства поверхности поддерживаемых липидных бислоев в нанометровом масштабе, измеренные с помощью зондов для гидрофобных и гидрофильных атомно-силовых микроскопов». Ленгмюра. 19. (2003) 1899–1907.
  20. ^ Робертсон Дж. Д. «Молекулярная структура и контактные отношения клеточных мембран». Прогресс биофизики и биофизической химии. 10. (1960) 343-418.
  21. ^ J. E. Heuser, T. S. Reese, M. J. Dennis, Y. Jan, L. Jan и L. Evans. "Экзоцитоз синаптических везикул, зафиксированный быстрым замораживанием и коррелированный с высвобождением квантового медиатора". Журнал клеточной биологии. 81. (1979) 275-300.
  22. ^ Д. Папахаджапулос и Н. Миллер. «Фосфолипидные модельные мембраны I. Структурные характеристики гидратированных жидких кристаллов». Biochimica et Biophysica Acta. 135. (1967) 624-638.
  23. ^ Смолл Д. М. "Фазовые равновесия и структура сухого и гидратированного яичного лецитина" Журнал исследований липидов. 8. (1967) 551-557.
  24. ^ Дж. Заккаи, Дж. К. Блази и Б. П. Шенборн «Нейтронографические исследования расположения воды в двухслойных модельных мембранах лецитина». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 72. (1975) 376-380.
  25. ^ Д. Боал, "Механика клетки". 2002, Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета.