Фосфопротеомика - Phosphoproteomics

Фосфопротеомика это филиал протеомика который определяет, каталогизирует и характеризует белки содержащий фосфатная группа как посттрансляционная модификация. Фосфорилирование является ключевой обратимой модификацией, которая регулирует функцию белка, субклеточную локализацию, комплексообразование, деградацию белков и, следовательно, клеточная сигнализация сети. С учетом всех этих результатов модификации, по оценкам, от 30% до 65% всех белков могут фосфорилироваться, иногда несколько раз.[1][2] Согласно статистическим оценкам из многих наборов данных, 230 000, 156 000 и 40 000 сайтов фосфорилирования должны существовать у человека, мыши и дрожжей соответственно.[2]

По сравнению с анализом экспрессии, фосфопротеомика предоставляет два дополнительных уровня информации. Во-первых, он дает представление о том, какой белок или какой путь может быть активирован, потому что изменение статуса фосфорилирования почти всегда отражает изменение активности белка. Во-вторых, это указывает на то, какие белки могут быть потенциальными мишенями для лекарств, на примере ингибитора киназы Gleevec. В то время как фосфопротеомика значительно расширит знания о количестве и типах фосфопротеинов, ее наибольшим потенциалом является быстрый анализ всей сигнальной сети, основанной на фосфорилировании.[3]

Обзор

Крупномасштабный фосфопротеомный анализ образца включает культивированные клетки, которые подвергаются СИЛАК кодирование; клетки стимулируются интересующим фактором (например, фактором роста, гормоном); стимуляция может происходить в течение различных периодов времени для временного анализа, клетки лизируются и ферментативно перевариваются, пептиды разделяются с использованием ионообменная хроматография; фосфопептиды обогащаются с помощью фосфоспецифических антитела, неподвижный металл аффинная хроматография или диоксид титана (TiO2) хроматография; фосфопептиды анализируются с использованием масс-спектрометрии, и пептиды секвенируются и анализируются.[4]

Инструменты и методы

Метод очистки фосфопротеинов иммунопреципитацией антифосфотирозиновыми антителами

Анализ всего набора фосфорилированных белков в клетке, безусловно, является возможным вариантом. Это связано с оптимизацией протоколов обогащения фосфопротеинов и фосфопептидов, улучшенными методами фракционирования с использованием хроматографии и улучшением методов селективной визуализации фосфорилированных остатков с помощью масс-спектрометрии. Несмотря на то, что текущие процедуры фосфопротеомного анализа значительно улучшены, по-прежнему существуют потери образцов и несоответствия в отношении подготовки, обогащения и инструментовки образцов. Инструменты биоинформатики и базы данных биологических последовательностей также необходимы для высокопроизводительных фосфопротеомных исследований.[5]

Стратегии обогащения

Включены предыдущие процедуры выделения фосфорилированных белков. радиоактивная маркировка с 32P-маркированный АТФ затем полиакриламид SDS гель-электрофорез или тонкослойная хроматография. Эти традиционные методы неэффективны, поскольку невозможно получить большое количество белков, необходимых для анализа фосфорилирования. Таким образом, текущие и самые простые методы обогащения фосфопротеинов - это аффинная очистка с использованием фосфоспецифических антител, аффинная хроматография с иммобилизованным металлом (IMAC ), хроматография с сильным катионообменом (SCX) или хроматография на диоксиде титана. Доказано, что антифосфотирозиновые антитела очень успешны в очистке, но было опубликовано меньше сообщений с использованием антител против фосфосерин- или фосфотреонинсодержащих белков. Обогащение IMAC основано на сродстве фосфата к иммобилизованному металлу, хелатирующему смолу. SCX отделяет фосфорилированные пептиды от нефосфорилированных на основе отрицательно заряженной фосфатной группы. Хроматография диоксидом титана - это новый метод, который требует значительно меньше времени на подготовку колонки. Во многих фосфопротеомных исследованиях используется комбинация этих стратегий обогащения для получения максимально чистого образца.

Масс-спектрометрический анализ

В настоящее время масс-спектрометрия является лучшим методом для адекватного сравнения пар образцов белков. Две основные процедуры для выполнения этой задачи используют изотопно-кодированные аффинити-теги (ICAT) и стабильные изотопные аминокислоты в культуре клеток (SILAC). В процедуре ICAT образцы маркируются индивидуально после выделения с помощью реагентов с масс-кодировкой, которые модифицируют остатки цистеина. В SILAC клетки культивируют отдельно в присутствии различных меченных изотопами аминокислот для нескольких клеточных делений, позволяя клеточным белкам включать метку. Масс-спектрометрия впоследствии используется для идентификации фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин-содержащих пептидов.[6]

Исследования передачи сигналов

Анализ динамики передачи сигнала

Передача внутриклеточного сигнала в первую очередь опосредуется обратимым фосфорилированием различных сигнальных молекул ферментами, названными киназы. Киназы переносят фосфатные группы из АТФ к конкретным серин, треонин или же тирозин остатки целевых молекул. Полученный фосфорилированный белок может иметь измененный уровень активности, субклеточную локализацию или третичную структуру.

Фосфопротеомный анализ идеален для изучения динамики сигнальных сетей. В одном исследовании клетки подвергаются маркировке SILAC и затем стимулируются определенным фактором роста. Клетки собирают в различные моменты времени, и лизаты объединяют для анализа с помощью тандемной МС.[4] Это позволяет экспериментаторам отслеживать состояние фосфорилирования многих фосфопротеинов в клетке с течением времени. Возможность измерить глобальное состояние фосфорилирования многих белков в различные моменты времени делает этот подход гораздо более мощным, чем традиционные биохимические методы анализа поведения сигнальной сети.[7]

Одно исследование позволило одновременно измерить кратность изменения состояния фосфорилирования 127 белков между нестимулированными и стимулированными EphrinB1 клетками.[8] Из этих 127 белков 40 показали повышенное фосфорилирование при стимуляции EphrinB1. Исследователи смогли использовать эту информацию в сочетании с ранее опубликованными данными для построения сети передачи сигнала для белков, расположенных ниже рецептора EphB2.

Другое недавнее фосфопротеомное исследование включало крупномасштабную идентификацию и количественную оценку событий фосфорилирования, запускаемых антидиуретическим гормоном вазопрессином в собирательном канале почек.[9] Всего было идентифицировано 714 сайтов фосфорилирования на 223 уникальных фосфопротеинах, включая три новых сайта фосфорилирования в чувствительном к вазопрессину водном канале аквапорин-2 (AQP2).

Исследования рака

С момента создания фосфопротеомики, рак исследования были сосредоточены на изменениях фосфопротеома во время опухоль разработка. Фосфопротеины могут быть маркерами рака, полезными для диагностики и лечения рака. Фактически, исследования показали, что существуют различные протеомы фосфотирозина опухолей груди и печени. Имеются также данные о гиперфосфорилировании остатков тирозина в опухолях груди, но не в нормальных тканях. Подобные результаты позволяют предположить, что фосфопротеом опухоли можно найти на предмет потенциальных биомаркеры.

Доступно все большее количество данных, предполагающих, что различные фосфопротеины существуют в различных опухолях и что профили фосфорилирования могут быть использованы для выявления раковых опухолей по отпечаткам пальцев различного происхождения. Кроме того, систематическая каталогизация опухолеспецифических фосфопротеинов у отдельных пациентов может выявить несколько причинных факторов во время формирования рака. Путем сопоставления этих экспериментальных данных с клиническими данными, такими как реакция на лекарство и исход болезни, можно определить потенциальные маркеры рака для диагностики, прогноза, прогнозирования ответа на лекарство и потенциальных мишеней для лекарств.[3]

Ограничения

Хотя фосфопротеомика значительно расширила знания о количестве и типах фосфопротеинов, а также об их роли в сигнальных сетях, эти методы все еще имеют несколько ограничений. Начнем с того, что методы выделения, такие как антифосфотирозиновые антитела, не делают различий между выделением белков, фосфорилированных тирозином, и белков, связанных с белками, фосфорилированными тирозином. Следовательно, даже несмотря на то, что зависимые от фосфорилирования взаимодействия белок-белок очень важны, важно помнить, что белок, обнаруживаемый этим методом, не обязательно является прямым субстратом какой-либо тирозинкиназы. Только путем переваривания образцов перед иммунопреципитацией можно выделить только фосфопротеины и получить временные профили отдельных сайтов фосфорилирования. Другое ограничение состоит в том, что некоторые релевантные белки, вероятно, будут упущены, поскольку условия экстракции не охватывают все. Возможно, что белки с низкой стехиометрией фосфорилирования, в очень низком количестве или фосфорилированные в качестве мишени для быстрой деградации будут потеряны.[10] Биоинформатический анализ данных фосфорилирования с низкой пропускной способностью вместе с данными фосфопротеомии с высокой пропускной способностью (основанный в основном на МС / МС) оценивает, что существующие протоколы с высокой пропускной способностью после нескольких повторений способны улавливать от 70% до 95% всех фосфопротеинов, но только 40 % до 60% от общего количества сайтов фосфорилирования.[2]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Коэн, Филипп (2002-05-01). «Истоки фосфорилирования белков». Природа клеточной биологии. 4 (5): E127–130. Дои:10.1038 / ncb0502-e127. ISSN  1465-7392. PMID  11988757.
  2. ^ а б c Властаридис, Панайотис; Кириакиду, Пелагея; Халиотис, Анаргирос; Ван де Пер, Ив; Оливер, Стивен Дж .; Амуциас, Григорис Д. (01.02.2017). «Оценка общего количества фосфопротеинов и сайтов фосфорилирования в протеомах эукариот». GigaScience. 6 (2): 1–11. Дои:10.1093 / gigascience / giw015. ISSN  2047-217X. ЧВК  5466708. PMID  28327990.
  3. ^ а б Лим, Ю. (2005). «Разработка опухолевого фосфопротеома на маркеры рака». Clin Cancer Res. 11 (9): 3163–3169. Дои:10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2243. PMID  15867208.
  4. ^ а б Olsen, СП; Благоев, Б; Gnad, F; Мацек, Б; Кумар, К; Mortensen, P; Манн, М. (2006). «Глобальная, in vivo и сайт-специфическая динамика фосфорилирования в сигнальных сетях». Клетка. 127 (3): 635–48. Дои:10.1016 / j.cell.2006.09.026. PMID  17081983.
  5. ^ Kalume, D .; Молина, Н; Панди, А (2003). «Борьба с фосфопротеомом: инструменты и стратегии». Современное мнение в области химической биологии. 7 (1): 64–69. Дои:10.1016 / S1367-5931 (02) 00009-1. PMID  12547428.
  6. ^ Schmelzle, K .; Уайт, Ф. (2006). «Фосфопротеомические подходы к прояснению сотовых сигнальных сетей». Современное мнение в области химической биологии. 17 (4): 406–414. Дои:10.1016 / j.copbio.2006.06.004.
  7. ^ Мамби, М; Бреккен, Д. (2005). «Фосфопротеомика: новое понимание клеточной сигнализации». Геномная биология. 6 (9): 230. Дои:10.1186 / gb-2005-6-9-230. ЧВК  1242200. PMID  16168091.
  8. ^ Чжан; Спеллман, Д.С. Skolnik, EY; Neubert, TA (2006). «Количественная фосфотирозиновая протеомика передачи сигналов EphB2 с помощью метки стабильного изотопа с аминокислотами в культуре клеток (SILAC)». J. Proteome Res. 5 (3): 581–8. Дои:10.1021 / pr050362b. ЧВК  2542903. PMID  16512673.
  9. ^ Hoffert, JD; Писиткун, Трайрак; Ван, Гуанхуэй; Шен, Ронг-Фонг; Неппер, М.А. (2006). «Количественная фосфопротеомика вазопрессин-чувствительных почечных клеток: регуляция фосфорилирования аквапорина-2 на двух участках». Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (18): 7159–64. Дои:10.1073 / pnas.0600895103. ЧВК  1459033. PMID  16641100.
  10. ^ Джонсон, S; Хантер, Т. (2004). «Фосфопротеомика находит свое время». Природа Биотехнологии. 22 (9): 1093–1094. Дои:10.1038 / nbt0904-1093. PMID  15340474.

внешняя ссылка