Фотореактивный аналог аминокислоты - Photo-reactive amino acid analog - Wikipedia
Фотореактивные аналоги аминокислот являются искусственными аналогами природных аминокислот, которые можно использовать для сшивания белковых комплексов.[1] Фотореактивные аналоги аминокислот могут быть включены в белки и пептиды. in vivo или в пробирка. Обычно используются фотореактивные аналоги аминокислот: фотореактивный диазирин аналоги лейцин и метионин, и параграф-бензоилфенилаланин. При воздействии ультрафиолетовый свет, они активируются и ковалентно связываются с взаимодействующими белками, которые находятся в пределах нескольких ангстремы фотореактивного аналога аминокислоты.
L-фото-лейцин и L-Фото-метионин являются аналогами встречающихся в природе L-Лейцин и L-Аминокислоты метионина, которые эндогенно включаются в первичную последовательность белков во время синтеза с использованием нормального аппарата трансляции. Затем они активируются ультрафиолетом (УФ) для ковалентного сшивания белков внутри белок-белковое взаимодействие домены в их родных in vivo среда. Метод позволяет определять и характеризовать как стабильные, так и временные белковые взаимодействия в клетках без добавления химических сшивающих агентов и связанных растворителей, которые могут отрицательно повлиять на клеточная биология изучается в эксперименте.
При использовании в сочетании с ограничивающей средой, лишенной лейцина и метионина, фотоактивируемые производные обрабатываются клетками как встречающиеся в природе аминокислоты. синтез белка машины. В результате они могут заменять лейцин или метионин в первичной структуре белков. Производные фото-лейцина и фото-метионина содержат диазириновые кольца, которые активируются при воздействии УФ-света и становятся реактивными промежуточными продуктами, которые образуют ковалентные связи с соседними белковыми боковыми цепями и скелетами. Естественно взаимодействующие белки внутри клетки могут быть мгновенно захвачены фотоактивация диазирин-содержащих белков в культивируемых клетках. Сшитые белковые комплексы можно обнаружить по снижению подвижности на SDS-PAGE с последующим Вестерн-блоттинг, эксклюзионная хроматография, сахароза седиментация в градиенте плотности или масс-спектрометрии.
Рекомендации
- ^ Сучанек, М .; Радзиковская, А .; Тиле, К. (2005). «Фото-лейцин и фото-метионин позволяют идентифицировать белок-белковые взаимодействия в живых клетках». Методы природы. 2 (4): 261–268. Дои:10.1038 / nmeth752. PMID 15782218.
- Вила-Перелло М. и др. (2007). Ковалентный захват фосфо-зависимой олигомеризации белков за счет сайт-специфического включения диазиринового фото-перекрестно-сшивающего линкера. Варенье. Chem. Soc., 129 (26): 8068–69.
- Бомгарден, Р. (2008). Изучение белковых взаимодействий в живых клетках. Gen. Eng. Новости. Vol. 28, № 7. [1]
- П.-О. Хету и др. (2008) Фото-кросслинкинг белков в интактных клетках показывает димерную структуру циклооксигеназы-2 и чувствительную к ингибитору олигомерную структуру микросомальной простагландин E2-синтазы-1. Arch. Biochem. Биофиз. Дои:10.1016 / j.abb.2008.04.038
- Weaver, M.S., et al. (2008) Медь-связывающий домен sparc опосредует выживание клеток in vitro через взаимодействие с интегрином бета 1 и активацию интегрин-связанной киназы. J. Biol. Chem. Дои:10.1074 / jbc.M706563200