Насосно-зондовая микроскопия - Pump-probe microscopy

Насосно-зондовая микроскопия это нелинейная оптика методы визуализации, используемые в фемтохимия учиться химические реакции. Он генерирует высококонтрастные изображения от эндогенных нефлуоресцентных мишеней. Он имеет множество приложений, в том числе материаловедение, лекарство, и художественная реставрация.

Преимущества

Классический метод нелинейного поглощения, используемый микроскопистами, является общепринятым. двухфотонная флуоресценция, в котором два фотона от одного источника взаимодействуют и возбуждают фотоэлектрон. Затем электрон испускает фотон, когда он возвращается в свое основное состояние. Этот метод микроскопии стал революционным в биологических науках из-за присущих ему возможностей трехмерного оптического сечения.

Двухфотонное поглощение по своей сути нелинейный процесс: интенсивность флуоресцентного излучения пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего света. Это гарантирует, что флуоресценция генерируется только в фокусе лазерного луча, так как интенсивность вне этой плоскости недостаточна для возбуждения фотоэлектрона.[1]

Однако возможности этого микроскопа по своей природе ограничены количеством биологических молекул, которые будут подвергаться обоим двухфотонное возбуждение и флуоресценция.[2]

Микроскопия с накачкой и зондом позволяет обойти это ограничение путем прямого измерения возбуждающего света. Это расширяет число потенциальных мишеней до любой молекулы, способной к двухфотонному поглощению, даже если она не флуоресцирует при релаксации.[3] Метод модулирует амплитуду импульсный лазер пучок, называемый накачкой, чтобы довести целевую молекулу до возбужденное состояние. Затем это повлияет на свойства второго когерентного пучка, называемого зондом, на основе взаимодействия двух пучков с молекулой. Затем эти свойства измеряются детектором для формирования изображения.

Физика накачно-зондовой микроскопии

Поскольку микроскопия с насос-зондом не полагается на флуоресцентные мишени, метод использует преимущества нескольких различных типов многофотонного поглощения.

Двухфотонное поглощение

Двухфотонное поглощение (TPA) - это процесс третьего порядка, в котором два фотона почти одновременно поглощаются одной и той же молекулой. Если второй фотон поглощается тем же электроном в одном квантовом событии, электрон попадает в возбужденное состояние.[4]

Это то же явление, что и в двухфотонная микроскопия (TPM), но есть две ключевые особенности, которые отличают микроскопию с насосом-зондом от TPM. Во-первых, поскольку молекула не обязательно флуоресцентная. фотоприемник измеряет интенсивность зонда. Следовательно, сигнал уменьшается по мере того, как происходит двухфотонное поглощение, в противоположность TPM.[3]

Во-вторых, в микроскопии с накачкой и зондом используются спектрально разделенные источники для каждого фотона, тогда как в обычном TPM используется один источник с одной длиной волны. Это называется вырожденным двухфотонным возбуждением.[3]

Поглощение возбужденного состояния

Поглощение возбужденного состояния (ESA) возникает, когда луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние, а затем зондирующий луч отправляет электрон в более высокое возбужденное состояние. Это отличается от TPA, прежде всего, во времени, в течение которого это происходит. Поскольку электрон может оставаться в возбужденном состоянии в течение наносекунды, что требует большей длительности импульса, чем TPA.[5]

Вынужденное излучение

Насосно-зондовая микроскопия также может измерять стимулированное излучение. В этом случае пучок накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Затем электрон излучает фотон при воздействии зондирующего луча. Это взаимодействие увеличит сигнал зонда на участке детектора.

Истощение основного состояния

Основное состояние обеднение происходит, когда пучок накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Однако, в отличие от ESA, зондирующий луч не может отправить электрон во вторичное возбужденное состояние. Вместо этого он отправляет оставшиеся электроны из основного состояния в первое возбужденное состояние. Однако, поскольку луч накачки уменьшил количество электронов в основном состоянии, меньше зондирующих фотонов поглощается и зондирующий сигнал увеличивается на участке детектора.[3]

Перекрестная фазовая модуляция

Межфазная модуляция вызвано Эффект Керра: в которой показатель преломления изменения образца в присутствии большого электрического поля.[6] В этом случае луч накачки модулирует фазу зонда, которая затем может быть измерена через интерферометрические методы. В некоторых случаях, называемых спектральный сдвиг кросс-фазовой модуляции, это изменение фазы вызывает изменение спектра накачки, которое может быть обнаружено с помощью спектрального фильтра.[3]

Оптический дизайн

Возбуждение

Измерение нелинейно-оптические взаимодействия требует высокого уровня мгновенной мощности и очень точного времени. Чтобы достичь большого количества фотонов, необходимых для генерации этих взаимодействий, избегая при этом повреждения хрупких образцов, этим микроскопам требуется лазер с синхронизацией по модам. Эти лазеры могут достигать очень большого количества фотонов на фемтосекунда шкала времени и поддерживать низкую среднюю мощность. В большинстве систем используется Ti: Sapph средний коэффициент усиления из-за широкого диапазона длин волн, к которому он может получить доступ.[3][7]

Обычно для создания насоса и зонда используется один и тот же источник. An оптический параметрический генератор (OPO) используется для преобразования зондирующего луча на желаемую длину волны. Длину волны зонда можно настраивать в широком диапазоне для спектроскопических приложений.[7]

Однако для некоторых типов двухфотонных взаимодействий можно использовать отдельные импульсные источники.[3] Это возможно только при таких взаимодействиях, как поглощение в возбужденном состоянии, при котором электроны остаются в возбужденном состоянии в течение нескольких пикосекунд. Однако более распространено использование одного фемтосекундного источника с двумя отдельными путями луча разной длины для модуляции синхронизации между лучами накачки и зонда.[3][7]

Амплитуда пучка накачки модулируется с помощью акустооптический или же электрооптический модулятор порядка 107 Гц. Затем пучки накачки и зонда рекомбинируют с помощью дихроичный светоделитель и сканировали с использованием гальванометрических зеркал для создания изображения по точкам перед фокусировкой на образце.[3]

Обнаружение

Сигнал, генерируемый модуляцией зонда, намного меньше, чем исходный луч накачки, поэтому два спектрально разделены в пределах пути обнаружения с помощью дихроичное зеркало. Сигнал зонда можно собирать с помощью различных типов фотоприемник обычно фотодиод. Затем модулированный сигнал усиливается с помощью синхронный усилитель настроен на частоту модуляции накачки.[3]

Анализ данных

Подобно анализу гиперспектральных данных, данные визуализации с помощью насоса-зонда, известные как стек задержки, необходимо обрабатывать для получения изображения с молекулярным контрастом лежащих в основе молекулярных частиц.[3] Обработка данных насос-зонд является сложной задачей по нескольким причинам - например, сигналы являются биполярными (положительными и отрицательными), многоэкспоненциальными и могут быть значительно изменены незначительными изменениями в химической среде.[8][9] Основными методами анализа данных насос-зонд являются многоэкспоненциальная аппроксимация, анализ главных компонент и фазовый анализ.[3][7]

Многоэкспоненциальная аппроксимация

При многоэкспоненциальной подгонке кривые с временным разрешением аппроксимируются экспоненциальный спад модель для определения констант распада. Хотя этот метод прост, он имеет низкую точность.[7]

Анализ главных компонентов

Анализ главных компонентов (PCA) был одним из самых ранних методов, используемых для анализа данных насос-зонд, поскольку он обычно используется для анализа гиперспектральных данных. PCA разбивает данные на ортогональные компоненты. В меланома исследованиях, основные компоненты показали хорошее согласие с сигналами, полученными от различных форм меланин.[10] Преимущество PCA состоит в том, что шум можно уменьшить, сохранив только основные компоненты, на которые приходится большая часть дисперсии данных. Однако основные компоненты не обязательно отражают фактические свойства лежащих в основе химических соединений, которые обычно не ортогональны.[3] Таким образом, ограничение состоит в том, что количество уникальных химических веществ не может быть выведено с помощью PCA.[3]

Фазорный анализ

Фазорный анализ обычно используется для микроскопия для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) анализ данных.[11] и был адаптирован для анализа данных визуализации насос-зонд [8] Сигналы раскладываются на их действительную и мнимую части. преобразование Фурье на заданной частоте. Сопоставляя действительную и мнимую части друг с другом, распределение различных хромофоры с различными сроками жизни могут быть отображены.[3][7] В исследованиях меланомы этот подход снова показал способность различать разные формы меланина.[8] Одним из основных преимуществ векторного анализа является то, что он обеспечивает интуитивно понятное качественное графическое представление контента.[7] Он также был объединен с PCA для количественного анализа.[12]

Приложения

Развитие высокоскоростных и высокочувствительных методов визуализации с помощью насоса-зонда позволило применять их в нескольких областях, таких как материаловедение, биология и искусство.[3][7]

Материаловедение

Визуализация с помощью насоса-зонда идеально подходит для изучения и определения характеристик наноматериалов, таких как графен,[13] нанокубы,[14] нанопровода[15] и различные полупроводники,[16][17] из-за их большой восприимчивости, но слабой флуоресценции. В частности, однослойные углеродные нанотрубки были тщательно изучены и отображены с субмикронным разрешением.[18] предоставление подробных сведений о динамике носителей, фотофизических и фотохимических свойствах.[19][20][21]

Биология

Первым применением метода «помпа-зонд» в биологии была визуализация in vitro стимулированного излучения меченых красителем клеток.[22] Насосно-зондовая визуализация в настоящее время широко используется для визуализации меланина, чтобы различать две основные формы меланина - эумеланин (коричневый / черный) и феомеланин (Красно-желтый).[23] При меланоме эумеланин значительно повышен. Следовательно, визуализация распределения эумеланина и феомеланина может помочь с высокой чувствительностью отличить доброкачественные образования и меланому.[24]

Изобразительное искусство

Произведение состоит из множества пигменты с широким спектром спектрально-поглощающих свойств, определяющих их цвет. Из-за широких спектральных характеристик этих пигментов идентификация конкретного пигмента в смеси затруднена. Визуализация с помощью насоса-зонда может предоставить точную молекулярную информацию с высоким разрешением[25] и различать пигменты, которые могут даже иметь одинаковый визуальный цвет.[26]

Рекомендации

  1. ^ Денк, Винфрид, Джеймс Х. Стриклер и Уотт У. Уэбб. «Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия». Science 248.4951 (1990): 73-76.
  2. ^ Зипфель, Уоррен Р., Ребекка М. Уильямс и Уотт У. Уэбб. «Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в биологических науках». Природная биотехнология 21.11 (2003): 1369.
  3. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п о п Фишер, Мартин С .; Уилсон, Джесси У .; Роблес, Франсиско Э .; Уоррен, Уоррен С. (2016). «Приглашенная обзорная статья: зондовая микроскопия». Обзор научных инструментов. 87 (3): 031101. Bibcode:2016RScI ... 87c1101F. Дои:10.1063/1.4943211. ISSN  0034-6748. ЧВК  4798998. PMID  27036751.
  4. ^ Диаспро, Альберто, Джузеппе Кирико и Маддалена Коллини. «Двухфотонное возбуждение флуоресценции и связанные с ним методы в биологической микроскопии». Ежеквартальные обзоры биофизики 38.2 (2005): 97-166.
  5. ^ Чжоу, Гуаньюн и др. «Двухфотонное поглощение и свойства поглощения возбужденного состояния органического красителя PSPI». Оптика связи 241.1-3 (2004): 215-219.
  6. ^ Салех, Бахаа Э.А., Малвин Карл Тейч. Основы фотоники. Vol. 22. Нью-Йорк: Wiley, 1991.
  7. ^ а б c d е ж грамм час Дун, Пу-Тин и Цзи-Синь Чэн. "Насосно-зондовая микроскопия: теория, приборы и приложения. «Спектроскопия 32.4 (2017): 2-11.
  8. ^ а б c Роблес, Франсиско Э. и др. «Фазорный анализ для нелинейной насосно-зондовой микроскопии». Оптика Экспресс 20.15 (2012): 17082-17092.
  9. ^ Симпсон, Мэри Джейн и др. «Динамика возбужденного состояния меланинов в ближнем инфракрасном диапазоне: влияние содержания железа, фотоповреждения, химического окисления и размера агрегатов». Журнал физической химии A 118.6 (2014): 993-1003.
  10. ^ Мэтьюз, Томас Э. и др. «Помповая визуализация позволяет дифференцировать меланому от меланоцитарных невусов». Трансляционная медицина науки 3.71 (2011): 71ra15-71ra15.
  11. ^ Дигман, Мишель А. и др. «Фазорный подход к анализу визуализации времени жизни флуоресценции». Биофизический журнал 94.2 (2008): L14-L16.
  12. ^ Роблес, Франсиско Э. и др. «Помповая визуализация первичных очагов пигментной меланомы кожи дает представление о метастатическом потенциале». Биомедицинская оптика Express 6.9 (2015): 3631-3645.
  13. ^ Ли, Джунджи и др. «Высокочувствительная визуализация переходного поглощения графена и оксида графена в живых клетках и циркулирующей крови». Научные отчеты 5 (2015): 12394.
  14. ^ Сталева, Христина; Хартленд, Грегори В. (2008). «Колебательная динамика серебряных нанокубов и нанопроволок, исследованная методом одночастичной нестационарной абсорбционной спектроскопии». Современные функциональные материалы. 18 (23): 3809–3817. Дои:10.1002 / adfm.200800605. ISSN  1616-301X.
  15. ^ Ло, Шун Шан и др. «Отображение степени возбуждения плазмонов в нанопроволоках Au с помощью микроскопии накачки». Optics Letters 38,8 (2013): 1265-1267.
  16. ^ Вонг, Кэти Ю. и др. «Выявление динамики экситона в низкомолекулярной органической полупроводниковой пленке с помощью микроскопии субдоменного переходного поглощения». Журнал физической химии C 117.42 (2013): 22111-22122.
  17. ^ Полли, Дарио и др. «Наноразмерное изображение динамики границы раздела в полимерных смесях с помощью фемтосекундной конфокальной микроскопии с насос-зондом». Дополнительные материалы 22.28 (2010): 3048-3051.
  18. ^ Тонг, Линг и др. «Получение изображений полупроводниковых и металлических углеродных нанотрубок в клетках и мышах без использования этикеток с использованием микроскопии переходного поглощения». Природные нанотехнологии 7.1 (2012): 56.
  19. ^ Лаурет, Жан-Себастьен и др. «Сверхбыстрая динамика носителей в одностенных углеродных нанотрубках». Письма о физических проверках 90.5 (2003): 057404.
  20. ^ Пак, Джэхонг, Правас Дерия и Майкл Дж. Териен. «Динамика и переходные спектральные характеристики поглощения электронно-возбужденного триплетного состояния одностенных углеродных нанотрубок». Журнал Американского химического общества 133,43 (2011): 17156-17159.
  21. ^ Юнг, Юкён и др. «Быстрое обнаружение металлического состояния отдельных однослойных углеродных нанотрубок с помощью оптического микроскопа с переходным поглощением». Письма физического обзора 105.21 (2010): 217401.
  22. ^ Dong, C.Y., et al. «Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью асинхронной микроскопии с накачкой и зондом». Биофизический журнал 69.6 (1995): 2234-2242.
  23. ^ Пилетик, Иван Р., Томас Э. Мэтьюз и Уоррен С. Уоррен. «Исследование путей фотрелаксации в ближнем инфракрасном диапазоне в эумеланинах и феомеланинах». Журнал физической химии A 114.43 (2010): 11483-11491.
  24. ^ Мэтьюз, Томас Э. и др. «In vivo и ex vivo эпирежимная помповая визуализация меланина и микрососудов». Биомедицинская оптика Экспресс 2.6 (2011): 1576-1583.
  25. ^ Виллафана, Тана Элизабет и др. «Фемтосекундная микроскопия с накачкой и зондом создает виртуальные сечения в исторических произведениях искусства». Труды Национальной академии наук 111.5 (2014): 1708-1713.
  26. ^ Саминени, Пратюш и др. «Насосно-зондовая визуализация исторических пигментов, используемых в картинах». Optics Letters 37,8 (2012): 1310-1312.