Транспозон Tn3 - Tn3 transposon

В Транспозон Tn3 это 4957 базовая пара мобильный генетический элемент, нашел в прокариоты. Он кодирует три белка:

Первоначально обнаруженная как репрессор транспозазы, резольваза также играет роль в облегчении репликации Tn3 (Sherratt 1989).

Транспозон фланкирован парой инвертированных повторов размером 38 п.н.

Механизм репликации

Репликативная интеграция. Синяя стрелка = транспозон, зеленый треугольник = сайт узнавания эндонуклеазы

Шаг 1 - Репликативная интеграция

Эта первая стадия катализируется транспозазой.

Плазмида, содержащая транспозон (донорская плазмида), сливается с плазмидой-хозяином (целевой плазмидой). При этом реплицируются транспозон и короткий участок ДНК хозяина. Конечный продукт представляет собой «коинтегрируемую» плазмиду, содержащую две копии транспозона.

Шапиро (1978)[1] предложил следующий механизм этого процесса:

  1. Происходит четыре одноцепочечных расщепления - по одному на каждой цепи донорной плазмиды и по одному на каждой цепи целевой плазмиды.
  2. Донорская и целевая плазмиды лигируются вместе, но есть две одноцепочечные области из-за расположения исходных расщеплений.
  3. Репликация ДНК делает одноцепочечные области двухцепочечными, используя существующую цепь в качестве матрицы. Именно на этой стадии реплицируется транспозон.
    N.B. Диаграмма не предназначена для точного представления трехмерной структуры.

Диаграммы справа показывают, каким образом положения расщеплений приводят к репликации определенных областей после слияния плазмид.

Шаг 2 - Разрешение

Реакция, катализируемая резольвазой Tn3

Чтобы разделить молекулы-хозяева и молекулы-мишени, резольваза Tn3 выполняет сайт-специфическую рекомбинацию между старой и новой копией транспозона в определенном сайте, называемом res, который присутствует в каждой копии транспозона. Res имеет длину 114 п.н. и состоит из 3 подсайтов, а именно сайтов I, II и III. Каждый из этих сайтов имеет разную длину (28, 34 и 25 п.н. соответственно), и они неравномерно распределены между сайтами I и II 22 п.н. и только 5 п.н. между сайтами II и III. Сайты состоят из инвертированных повторяющихся мотивов длиной 6 пар оснований, фланкирующих центральную последовательность переменной длины. Эти мотивы действуют как сайты связывания для резольвазы, так что каждый сайт связывает димер резольвазы, но с разным сродством и, вероятно, с немного другой архитектурой комплекса белок-ДНК.[2][3] Все три субсайта необходимы для рекомбинации.

При рекомбинации два непосредственно повторяющихся сайта res с димерами резольвазы, связанными с каждым участком, объединяются, образуя большую сложную структуру, называемую синаптосомой. Резолваза, связанная с сайтами II и III, инициирует сборку этого комплекса. В этой структуре, точная архитектура которой до сих пор неясна, два сайта res переплетены таким образом, что сопоставляются две копии сайта I, позволяя димерам резольвазы связываться с каждым сайтом с образованием тетрамера. Опять же, именно взаимодействие между димерами резольвазы, связанными в дополнительных сайтах (сайты II и III), и резольвазой в сайте I, заставляет два димера синапсировать и формировать тетрамер. После образования тетрамера он активируется, и верхняя и нижняя цепи ДНК одновременно расщепляются в середине сайта I с выступом в 2 п.н. Обмен цепями происходит по еще неизвестному механизму, в результате чего получается поворот на 180 °. За обменом цепей следует повторное лигирование (Stark et al., 1992). Рекомбинация между двумя непосредственно повторяющимися сайтами res разделяет или разрешает "коинтеграцию" на две исходные молекулы, каждая из которых теперь содержит копию транспозона Tn3. После разделения эти две молекулы остаются связанными в виде простой двухузловой катенаны, которую можно легко разделить. in vivo по типу II топоизомераза (Гриндли 2002). Система резольвазы дикого типа абсолютно требует суперскрученный субстрат и что сайты рекомбинации ориентированы в прямом повторе на одной и той же молекуле ДНК. Однако был выделен ряд «дерегулированных» или «гиперактивных» мутантов, которые утратили потребность в дополнительных сайтах. Эти мутанты способны катализировать рекомбинацию только между двумя копиями сайта I, что в основном уменьшает размер сайта рекомбинации с 114 до 28 пар оснований.[4][5] Кроме того, у этих мутантов нет суперспирализация или требования к связности (Arnold et al., 1999), и было показано, что они работают в клетках млекопитающих.[6] Мутанты с гиперактивной резольвазой до сих пор доказали свою полезность для создания резольваз с измененной специфичностью последовательности.[7] но также и в строительных работах.[8]

Полная реакция рекомбинации резольвазы может быть воспроизведена in vitro, требующие только резольвазы, субстратной ДНК и поливалентных катионов, с использованием белков дикого типа или гиперактивных мутантов.[4][9]

Гиперактивные мутанты резольвазы, если будут развиваться дальше, могут стать альтернативой Cre и ФЛП, наиболее часто используемые системы рекомбинации в молекулярной биологии на сегодняшний день.

Рекомендации

  1. ^ Шапиро, Джеймс (апрель 1979 г.). «Молекулярная модель транспозиции и репликации бактериофага Mu и других мобильных элементов». PNAS. 76 (4): 1933–1937. Bibcode:1979ПНАС ... 76. 1933С. Дои:10.1073 / пнас.76.4.1933. ЧВК  383507. PMID  287033.
  2. ^ Абдель-Мегид СС, Гриндли Н.Д., Темплтон Н.С., Стейтц Т.А. (апрель 1984 г.). «Расщепление сайт-специфической рекомбинации белка гамма-дельта-резольвазой: меньший из двух фрагментов специфически связывает ДНК». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 81 (7): 2001–5. Bibcode:1984PNAS ... 81.2001A. Дои:10.1073 / пнас.81.7.2001. ЧВК  345424. PMID  6326096.
  3. ^ Blake DG, Boocock MR, Sherratt DJ, Stark WM (сентябрь 1995 г.). «Совместное связывание мономеров резольвазы Tn3 с функционально асимметричным сайтом связывания». Curr. Биол. 5 (9): 1036–46. Дои:10.1016 / S0960-9822 (95) 00208-9. PMID  8542280.
  4. ^ а б Арнольд PH, Блейк Д.Г., Гриндли Н.Д., Букок М.Р., Старк В.М. (март 1999 г.). «Мутанты резольвазы Tn3, которым не требуются дополнительные сайты связывания для активности рекомбинации». EMBO J. 18 (5): 1407–14. Дои:10.1093 / emboj / 18.5.1407. ЧВК  1171230. PMID  10064606.
  5. ^ Берк М.Э., Арнольд П.Х., Хе Дж. И др. (Февраль 2004 г.). «Активирующие мутации маркеров Tn3-резольвазы, важные в катализе рекомбинации и ее регуляции». Мол. Микробиол. 51 (4): 937–48. Дои:10.1046 / j.1365-2958.2003.03831.x. PMID  14763971.
  6. ^ Schwikardi M, Dröge P (апрель 2000 г.). «Сайт-специфическая рекомбинация в клетках млекопитающих, катализируемая мутантами гаммадельта-резольвазы: последствия для топологии эписомальной ДНК». FEBS Lett. 471 (2–3): 147–50. Дои:10.1016 / S0014-5793 (00) 01394-6. PMID  10767411.
  7. ^ Акопян А., Хе Дж., Букок М.Р., Старк В.М. (июль 2003 г.). «Химерные рекомбиназы с продуманным распознаванием последовательности ДНК». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 100 (15): 8688–91. Bibcode:2003ПНАС..100.8688А. Дои:10.1073 / pnas.1533177100. ЧВК  166373. PMID  12837939.
  8. ^ Ли В., Камтекар С., Сюн Й., Саркис Г.Дж., Гриндли Н.Д., Стейтц Т.А. (август 2005 г.). «Структура тетрамера синаптической гаммадельта-резольвазы, ковалентно связанного с двумя расщепленными ДНК». Наука. 309 (5738): 1210–5. Bibcode:2005Научный ... 309.1210Л. Дои:10.1126 / science.1112064. PMID  15994378.
  9. ^ Рид Р. Р., Гриндли Н. Д. (сентябрь 1981 г.). «Опосредуемая транспозоном сайт-специфическая рекомбинация in vitro: расщепление ДНК и связывание белок-ДНК в сайте рекомбинации». Клетка. 25 (3): 721–8. Дои:10.1016/0092-8674(81)90179-3. PMID  6269756.
  • Шерратт, Д. Дж. (1989). Tn3 и родственные мобильные элементы: сайт-специфическая рекомбинация и транспозиция. In Berg, D. E., Howe, M. (eds) Mobile DNA. Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 163–184.
  • Гриндли, Н.Д.Ф. (2002). Движение Tn3-подобных элементов: транспонирование и разрешение коинтеграции. In Mobile DNA II, Craig, N., Craigie, R., Gellert, M. и Lambowitz, A. (ed.), Стр. 272–302. ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия, США