Осаждение сульфатом аммония - Ammonium sulfate precipitation

Осаждение сульфатом аммония это один из наиболее часто используемых методов для крупномасштабной и лабораторной очистки и фракционирования белков, который можно использовать для разделения белков путем изменения их растворимость при наличии высокой концентрации соли.

Характеристики

Сульфат аммония представляет собой неорганическую соль с высокой растворимостью, которая диссоциирует на аммоний (NH4+) и сульфат (SO42−) в водных растворах.[1] Сульфат аммония особенно полезен в качестве осадителя, поскольку он хорошо растворим, стабилизирует структуру белка, имеет относительно низкую плотность, легко доступен и относительно недорого.

Механизм

Сульфат аммония, как и другие нейтральные соли, стабилизирует белки путем льготная сольватация. Белки обычно хранятся в сульфате аммония, поскольку он подавляет рост бактерий. С добавлением сульфата аммония белки, развернутые денатурантами, могут быть переведены в их естественную конформацию. Это можно увидеть при сворачивании рекомбинантных белков.[2]

Растворимость белков зависит от ионной силы раствора и, следовательно, от концентрации соли. При низких концентрациях ионов (<0,5 М) растворимость белков увеличивается с увеличением концентрации соли, эффект, называемый «засолка ". По мере дальнейшего увеличения концентрации соли растворимость белка начинает снижаться. При достаточно высокой ионной силе белок будет выпадать в осадок из раствора, эффект называется".высаливание ".[3] Когда аммоний (NH4+) и сульфат (SO42−) ионы находятся в водном растворе, они притягиваются к противоположным зарядам, что очевидно на очищаемом соединении. Это притяжение противоположных зарядов предотвращает взаимодействие молекул воды с очищаемым соединением, что приводит к осаждению или «высаливанию».[2]

Белки заметно различаются по своей растворимости при высокой ионной силе, поэтому «высаливание» является очень полезной процедурой, способствующей очистке желаемого белка. Сульфат аммония обычно используется для осаждения из-за его высокой растворимости, кроме того, он образует два иона с высоким содержанием Серия Хофмайстера. Поскольку эти два иона находятся в конце ряда Хофмайстера, сульфат аммония также может стабилизировать структуру белка.[3] Поведение растворимости сульфата аммония для белка обычно выражается как функция процента насыщения. Кривая растворимости может быть определена путем построения логарифма экспериментально определенной растворимости, выраженной в мг / мл, в зависимости от процентного насыщения сульфата аммония.[4]

При механизме высаливания происходит выпадение соли из слоя воды, который тесно связан с поверхностью белка, известного как гидратный слой. Слой гидратации играет жизненно важную роль в поддержании растворимости и подходящей естественной конформации. Существует три основных взаимодействия белка с водой: гидратация ионов между заряженными боковыми цепями, водородная связь между полярными группами и водой и гидрофобная гидратация. После добавления соли в смесь увеличивается поверхностное натяжение воды, что увеличивает гидрофобные взаимодействия между водой и интересующим белком. Затем интересующий белок уменьшает свою площадь поверхности, что уменьшает его контакт с растворителем. Об этом свидетельствует сворачивание и самоассоциация, что в конечном итоге приводит к выпадению осадков. Сворачивание и самоассоциация белка вытесняет свободную воду, что приводит к увеличению энтропии и делает этот процесс энергетически выгодным.[2]

Процедура

Обычно концентрацию сульфата аммония повышают ступенчато, и осажденный белок восстанавливают на каждой стадии. Обычно это делается путем добавления твердого сульфата аммония; однако вычисление количества сульфата аммония, которое следует добавить в раствор для достижения желаемой концентрации, может быть затруднено, поскольку добавление сульфата аммония значительно увеличивает объем раствора. Количество сульфата аммония, которое следует добавить в раствор, можно определить по опубликованным номограммам или с помощью онлайн-калькулятора.[5] Прямое добавление твердого сульфата аммония изменяет pH раствора, что может привести к потере активности фермента.[6] В этих случаях добавление насыщенного сульфата аммония в подходящий буфер используется в качестве альтернативы добавлению твердого сульфата аммония. При любом подходе полученный осадок белка может быть растворен индивидуально в стандартном буфере и проанализирован для определения общего содержания белка.

Добавляемая концентрация сульфата аммония должна быть увеличена до значения, при котором будет осаждаться большая часть интересующего белка, при этом максимальное количество белковых примесей все еще остается в растворе. Представляющий интерес осажденный белок впоследствии может быть восстановлен с помощью центрифугирование и растворяют в стандартном буфере для подготовки образца к следующей стадии очистки.

На следующем этапе очистки всю эту добавленную соль нужно удалить из белка. Один из способов сделать это - использовать диализ, но диализ еще больше разбавляет концентрированный белок. Лучший способ удаления сульфата аммония из белка - это смешивание осадка белка в буфере, содержащем смесь SDS, трис-HCl и фенола, и центрифугирование смеси. Осадок, который выпадает после центрифугирования, будет содержать бессолевой концентрированный белок.[7]

Приложения

Осаждение сульфатом аммония - полезный метод в качестве начального этапа очистки белка, поскольку он обеспечивает быстрое массовое осаждение клеточных белков.[4] Его также часто используют на более поздних стадиях очистки для концентрирования белка из разбавленного раствора в соответствии с такими процедурами, как гель-фильтрация. Недостатком этого метода является то, что часто вместе с белком могут выпадать в осадок различные вещества, и необходимо применять другие методы очистки, такие как ионная хроматография или эксклюзионная хроматография.[3]

Рекомендации

  1. ^ "Сульфат аммония". PubChem. Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США. Получено 2017-05-05.
  2. ^ а б c Вингфилд П. (май 2001 г.). «Осаждение белка сульфатом аммония». Текущие протоколы в науке о белке. Приложение 3 (1): A.3F.1 – A.3F.8. Дои:10.1002 / 0471140864.psa03fs13. ISBN  0471140864. ЧВК  4817497. PMID  18429073.
  3. ^ а б c Duong-Ly KC, Gabelli SB (2014). «Высаливание белков осаждением сульфатом аммония». Методы в энзимологии. 541: 85–94. Дои:10.1016 / B978-0-12-420119-4.00007-0. ISBN  9780124201194. PMID  24674064.
  4. ^ а б Берджесс Р.Р. (2009). «Методы осаждения белков». Методы в энзимологии. 463: 331–42. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63020-2. PMID  19892180.
  5. ^ «Калькулятор сульфата аммония». EnCor Biotechnology Inc. Получено 19 апреля 2013.
  6. ^ «[7a] Синтаза жирных кислот из куриной печени». ScienceDirect. 1975-01-01. С. 59–65. Дои:10.1016/0076-6879(75)35138-0. ISSN  0076-6879. Получено 2020-10-31.
  7. ^ Ван В., Лю QJ, Цуй Х. (июль 2007 г.). «Быстрое обессоливание и восстановление белка фенолом после фракционирования сульфатом аммония». Электрофорез. 28 (14): 2358–60. Дои:10.1002 / elps.200600743. PMID  17577882. S2CID  33402573.