CITE-Seq - CITE-Seq

CITE-Seq (Cэллиптический яопределение Траскриптомы и Epitopes от Sequencing) - метод выполнения Секвенирование РНК наряду с получением количественной и качественной информации о поверхностных белках с доступными антителами на уровне отдельной клетки. До сих пор было продемонстрировано, что этот метод работает только с несколькими белками на клетку. Таким образом, он обеспечивает дополнительный уровень информации для одной и той же ячейки путем объединения обоих протеомика и данные транскриптомики. Для фенотипирования этот метод оказался столь же точным, как и проточной цитометрии (золотой стандарт) группами, которые его разработали.[1] В настоящее время это один из основных методов, наряду с REAP-Seq, для одновременной оценки как экспрессии генов, так и уровней белка у разных видов.

Метод был установлен Нью-Йоркский центр генома в сотрудничестве с Satija lab.[1]

Приложения

Одновременное измерение уровней белка и транскрипта открывает возможности для использования CITE-Seq в различных биологических областях, некоторые из которых были затронуты разработчиками. Например, его можно использовать для характеристики неоднородности опухоли при различных видах рака, что является основной областью исследований.[2] Это также позволяет идентифицировать редкие субпопуляции ячеек как высокопроизводительный одноклеточный метод и, таким образом, обнаруживать информацию, потерянную в противном случае с помощью массовых методов.[2] Это также может помочь в классификации опухолей - например, в идентификации новых подтипов.[2] Все вышеперечисленное возможно благодаря тому, что данные белка и транскрипта выводятся одной клеткой одновременно, что также приводит к новой информации о корреляции белок-РНК.

Он также имеет потенциал в иммунологии. Например, его можно использовать для характеристики иммунных клеток - недавнее исследование Т-клеток исследовало способность Т-клеток поддерживать эффекторное состояние.[3] Другое исследование, проведенное одним из соавторов CITE-Seq, предложило CITE-Seq в качестве метода изучения механизмов взаимодействия хозяина и патогена.[4]

Рабочий процесс

CITE-seq, как и любой другой метод секвенирования, имеет влажную лабораторную часть, где готовятся фактические антитела, окрашиваются клетки, кДНК синтезируются библиотеки РНК, которые затем секвенируются, а также сухая лабораторная часть для анализа полученных данных секвенирования. Самая важная часть экспериментов в мокрой лаборатории - проектирование конъюгаты антитело-олигонуклеотид и титрование количества каждого конъюгата, которое должно присутствовать в пуле для достижения желаемого считывания и количественной оценки.

Схема рабочего процесса влажной лаборатории для CITE-Seq

Рабочий процесс влажной лаборатории

Первый этап включает приготовление конъюгатов антитело-олиго, также известных как АантителоDвозник Тагенты (ADT). Приготовление ADT включает мечение антитела, направленного против представляющего интерес белка клеточной поверхности, олигонуклеотидами для штрих-кодирования антитела.

Когда у вас есть ADT, следующий шаг - связать ячейки с желаемым пулом ADT. Библиотеки scRNA-seq могут быть получены с использованием Drop-seq, 10X Genomics или методы ddSeq. Вкратце, меченые ADT клетки инкапсулируются внутри капли как отдельные клетки с микрогранулами со штрих-кодом ДНК.[5]

Затем в капле клетки лизируются для высвобождения как связанных АДТ, так и мРНК. Затем они превращаются в кДНК. Каждая последовательность ДНК на микрошарике имеет уникальный штрих-код, таким образом индексируя кДНК штрих-кодами клеток. кДНК получают как из ADT, так и из клеточных мРНК.

На следующем этапе, в соответствии с рекомендациями разработчика, кДНК амплифицируется с помощью ПЦР, и кДНК ADT и кДНК мРНК разделяются в зависимости от размера (обычно кДНК, полученные из ADT, имеют размер <180 п.н., а кДНК, полученные из мРНК, составляют> 300 п.н.).[6] Каждую из разделенных молекул кДНК независимо амплифицируют и очищают для получения библиотек секвенирования. Наконец, независимые библиотеки объединяются и упорядочиваются. Таким образом, данные протеомики и транскриптомики могут быть получены из одного цикла секвенирования.

Схема рабочего процесса сухой лаборатории для CITE-Seq

Рабочий процесс сухой лаборатории

Анализ секвенирования отдельных клеток представляет собой множество проблем, таких как определение наилучшего способа нормализации данных.[7] Из-за нового уровня осложнений, возникающих при секвенировании как белков, так и транскриптов на уровне отдельной клетки, разработчики CITE-Seq и их сотрудники поддерживают несколько инструментов для помощи в анализе данных.

Анализ данных scRNA-Seq на основе рекомендаций разработчика:[1][8] Первоначальные этапы анализа такие же, как и в стандартном scRNA-Seq эксперимент. Во-первых, считывания необходимо выровнять с эталонным геномом интересующего вида, а клетки с очень низким числом транскриптов, сопоставленных эталону, удаляются. Наконец, получают нормализованную матрицу подсчета со значениями экспрессии генов.

Анализ данных ADT[1][6][9][10] (на основе рекомендаций разработчика): CITE-seq-Count - это пакет Python от разработчиков CITE-Seq, который можно использовать для получения необработанных подсчетов. Пакет Seurat из лаборатории Satija также позволяет комбинировать подсчеты белка и РНК и выполнять кластеризацию обоих измерений, а также выполнять анализ дифференциальной экспрессии между интересующими кластерами клеток. Количественная оценка ADT должна учитывать различия между антителами. Кроме того, для уменьшения шума может потребоваться фильтрация, аналогично scRNA-Seq анализ. Но в отличие от данных по РНК, из-за большего количества белка в клетке выпадение меньше.

Анализ может привести к идентификации новых кластеров клеток с помощью таких методов, как PCA или tSNE, важнейших генов, ответственных за конкретную функцию клетки, и других новых знаний, специфичных для интересующего вопроса. В общем, результаты, полученные с помощью подсчета ADT, существенно увеличивают объем информации, полученной с помощью транскриптомики отдельных клеток.

Адаптации техники

Схема хеширования ячеек

Применение конъюгатов антитело-олигонуклеотид расширилось за пределы CITE-seq и может быть адаптировано для мультиплексирования образцов, а также CRISPR экраны.

Хеширование ячеек: Нью-Йоркский центр генома дополнительно адаптировали использование своих конъюгатов антитело-олигонуклеотид, чтобы обеспечить мультиплексирование образцов для scRNA-seq. Этот метод называется "хеширование ячеек",[11] использует меченые олигонуклеотидами антитела против повсеместно экспрессируемых белков клеточной поверхности из определенного образца ткани. В этом случае олигонуклеотидная последовательность содержит уникальный штрих-код, который будет специфичным для клеток из разных образцов. Эта специфичная для образца маркировка клеток позволяет объединить библиотеки секвенирования, приготовленные из различных образцов, на платформе для секвенирования. Секвенирование меток антител вместе с клеточным транскриптомом помогает идентифицировать образец происхождения для каждой анализируемой клетки. Уникальная последовательность штрих-кода, используемая в антителе для хэширования клеток, может быть сконструирована таким образом, чтобы отличаться от штрих-кода антитела, присутствующего на ADT, используемых в CITE-seq. Это позволяет объединить хеширование ячеек с CITE-seq за один прогон секвенирования.[11] Хеширование клеток обеспечивает сверхзагрузку платформы scRNA-seq, что снижает стоимость секвенирования. Он также позволяет обнаруживать искаженные сигналы от мультиплетов, что является серьезной проблемой в scRNA-seq. Метод хеширования ячеек также использовался Gaublomme et al. для мультиплексирования одноядерной РНК-seq (snRNA-seq ) путем выполнения хеширования ядра.[12]

ECCITE-seq: Eрасширенный CRISPR-совместимый Cэллиптический яопределение Траскриптомы и Epitopes путем секвенирования или ECCITE-seq был разработан для применения CITE-seq для характеристики нескольких модальностей из одной клетки. Путем модификации основного протокола CITE-seq на анализ scRNA-seq на основе 5’-тегов он может обнаруживать транскриптом, клонотипы иммунных рецепторов, поверхностные маркеры, идентичность образцов и одиночные направляющие РНК (sgRNA) из каждой отдельной клетки.[13] Способность ECCITE-seq обнаруживать молекулы sgRNA и измерять их влияние на уровни экспрессии генов открывает перспективу применения этого метода в CRISPR-экранах.

Преимущества и ограничения CITE-seq

Преимущества: CITE-seq позволяет одновременно анализировать транскриптом и протеом отдельных клеток. Предыдущие усилия по объединению измерений сортировки по индексу из отдельных видов клеток с scRNA-seq были ограничены запуском небольшого размера выборки и были несовместимы с мультиплексированием и массовым параллельным высокопроизводительным секвенированием. Было показано, что CITE-seq совместим с высокопроизводительными микрожидкостными платформами, такими как 10X Genomics и Drop-seq. Он также может быть адаптирован к платформам с микро- и нано-лунками. Сочетание этого с хешированием ячеек позволяет применять CITE-seq к объемным образцам и их мультиплексированию. Эти методы работают, чтобы снизить общую стоимость высокопроизводительного секвенирования нескольких образцов. Наконец, CITE-seq может быть адаптирован для обнаружения малых молекул, РНК-интерференции, CRISPR и других методов редактирования генов.

Ограничения: Одним из ограничений CITE-Seq является потеря информации о местоположении. Из-за способа обращения с клетками пространственное распределение клеток в образце, а также белков внутри клетки неизвестно.[14][8] Кроме того, этот метод разделяет проблемы scRNA-Seq, такие как высокий уровень шума и возможные проблемы при обнаружении слабо экспрессируемых генов.[8] С точки зрения фенотипирования, оптимизация анализа и антител также представляет потенциальную проблему, если интересующие белки не включены в доступные в настоящее время панели.[15] Более того, сейчас CITE-Seq не может обнаруживать внутриклеточные белки.[15] С текущим протоколом существует много проблем, которые могут возникнуть на этапе повышения проницаемости, что ограничивает метод поверхностными маркерами.

Альтернативные методы

  • REAP-seq: Peterson et al. от Merck разработала методику, аналогичную CITE-seq, которая называется анализом экспрессии РНК и секвенирования белков (REAP-seq). Хотя REAP-seq, как и CITE-seq, измеряет уровни как транскриптов, так и белков в одной клетке, разница между двумя методами заключается в том, как антитело конъюгировано с олигонуклеотидами. CITE-seq обычно связывает олигонуклеотид с антителом нековалентно посредством конъюгации стрептавидина с антителом и конъюгирования биотина с олигонуклеотидом. REAP-seq ковалентно связывает антитело и штрих-код аминированной ДНК[16]
  • ИГРОК: PLAYR или Proximal Ligation Assay for RNA использует масс-спектрометрию для одновременного анализа уровней транскриптома и белка в отдельных клетках. В этом методе и белки, и транскрипты РНК помечаются изотопно-конъюгированными антителами и изотопно-меченными зондами соответственно, что позволяет их обнаруживать на масс-спектрометре.[17]

использованная литература

  1. ^ а б c d Стоецкий, Марлон; Хафемейстер, Кристоф; Стивенсон, Уильям; Хаук-Лумис, Брайан; Chattopadhyay, Pratip K; Свердлоу, Гарольд; Сатия, Рахул; Смиберт, Питер (31.07.2017). «Одновременное измерение эпитопа и транскриптома в отдельных клетках». Методы природы. 14 (9): 865–868. Дои:10.1038 / nmeth.4380. ISSN  1548-7091. ЧВК  5669064. PMID  28759029.
  2. ^ а б c Тирош, Итай; Сува, Марио Л. (16.11.2018). «Расшифровка биологии опухоли человека с помощью профилирования экспрессии отдельных клеток». Ежегодный обзор биологии рака. 3 (1): 151–166. Дои:10.1146 / annurev-Cancebio-030518-055609. ISSN  2472-3428. S2CID  53969464.
  3. ^ Гутьеррес-Арселус, Мария; Теслович, Никола; Mola, Alex R .; Polidoro, Rafael B .; Натан, Апарна; Ким, Хён; Ханнес, Сьюзен; Словиковски, Камил; Уоттс, Джеральд Ф. М. (8 февраля 2019 г.). «Врожденность лимфоцитов, определяемая состояниями транскрипции, отражает баланс между пролиферацией и эффекторными функциями». Nature Communications. 10 (1): 687. Bibcode:2019НатКо..10..687Г. Дои:10.1038 / s41467-019-08604-4. ISSN  2041-1723. ЧВК  6368609. PMID  30737409.
  4. ^ Chattopadhyay, Pratip K .; Родерер, Марио; Болтон, Дайан Л. (2018-11-06). «Смертельный танец: хореография взаимодействий хозяин-патоген, выявленная одноклеточными технологиями». Nature Communications. 9 (1): 4638. Bibcode:2018НатКо ... 9.4638C. Дои:10.1038 / s41467-018-06214-0. ISSN  2041-1723. ЧВК  6219517. PMID  30401874.
  5. ^ Macosko, Evan Z .; Басу, Аниндита; Сатия, Рахул; Немеш, Джеймс; Шекхар, Картик; Гольдман, Мелисса; Тирош, Итай; Bialas, Allison R .; Камитаки, Нолан (май 2015 г.). «Профилирование экспрессии отдельных клеток с высокой параллельностью генома с использованием капель нанолитера». Ячейка. 161 (5): 1202–1214. Дои:10.1016 / j.cell.2015.05.002. ISSN  0092-8674. ЧВК  4481139. PMID  26000488.
  6. ^ а б "CITE-seq". CITE-seq. Получено 2019-02-27.
  7. ^ Гао, Шань (2018), «Анализ данных в секвенировании транскриптома отдельных клеток», Вычислительная системная биология, Методы молекулярной биологии, 1754, Springer New York, стр. 311–326, Дои:10.1007/978-1-4939-7717-8_18, ISBN  9781493977161, PMID  29536451
  8. ^ а б c Лю, Серена; Трапнелл, Коул (17 февраля 2016 г.). «Секвенирование одноклеточного транскриптома: последние достижения и нерешенные проблемы». F1000 Исследования. 5: 182. Дои:10.12688 / f1000research.7223.1. ISSN  2046-1402. ЧВК  4758375. PMID  26949524.
  9. ^ Роэлли, Патрик (23.02.2019), Небольшой скрипт, который позволяет подсчитывать ТЕГИ из эксперимента CITE-seq: Hoohm / CITE-seq-Count, получено 2019-02-27
  10. ^ "Сёра". satijalab.org. Получено 2019-02-27.
  11. ^ а б Стоецкий, Марлон; Чжэн, Шивэй; Хаук-Лумис, Брайан; Хао, Стефани; Юнг, Бертран; Смиберт, Питер; Сатия, Рахул (21 декабря 2017 г.). «Клеточное« хеширование »со штрих-кодом антител делает возможным мультиплексирование и обнаружение дублетов для геномики одиночных клеток». Дои:10.1101/237693. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)
  12. ^ Gaublomme, Jellert T .; Ли, Бо; Маккейб, Кристин; Кнехт, Абигейл; Дрохлянский, Евгений; Ван Виттенберг, Николас; Уолдман, Джулия; Дионн, Даниэль; Нгуен, Лан (23.11.2018). «Мультиплексирование ядер с помощью штрих-кодов антител для одноядерной геномики». bioRxiv. Дои:10.1101/476036.
  13. ^ Мимиту, Элени; Ченг, Энтони; Монтальбано, Антонино; Хао, Стефани; Стоецкий, Марлон; Легут, Матеуш; Руш, Тимоти; Эррера, Альберто; Папалекси, Эфтимия (8 ноября 2018 г.). «Расширение набора инструментов CITE-seq: обнаружение белков, транскриптомов, клонотипов и нарушений CRISPR с мультиплексированием в одном анализе». bioRxiv. Дои:10.1101/466466.
  14. ^ Ань, Синъюэ; Варадараджан, Навин (март 2018 г.). «Одноклеточные технологии для профилирования Т-клеток, позволяющие контролировать иммунотерапию». Текущее мнение в области химической инженерии. 19: 142–152. Дои:10.1016 / j.coche.2018.01.003. ISSN  2211-3398. ЧВК  6530921. PMID  31131208.
  15. ^ а б Барон, Мааян; Янаи, Итаи (24.08.2017). «Новая кожа для старой церемонии RNA-Seq: эра одноклеточных мультиомиков». Геномная биология. 18 (1): 159. Дои:10.1186 / s13059-017-1300-5. ISSN  1474-760X. ЧВК  5571565. PMID  28837001.
  16. ^ Петерсон, Ванесса М; Чжан, Кельвин Си; Кумар, Намит; Вонг, Джерелин; Ли, Ликсия; Уилсон, Дуглас С; Мур, Рене; МакКланахан, Террилл К.; Садекова, Светлана (30.08.2017). «Мультиплексное количественное определение белков и транскриптов в отдельных клетках». Природа Биотехнологии. 35 (10): 936–939. Дои:10.1038 / nbt.3973. ISSN  1087-0156. PMID  28854175.
  17. ^ Frei, Andreas P; Бава, Феличе-Алессио; Зундер, Эли Р.; Hsieh, Elena W. Y; Чен, Ши-Ю; Нолан, Гарри П.; Герардини, Пьер Федерико (25 января 2016 г.). «Высоко мультиплексное одновременное обнаружение РНК и белков в отдельных клетках». Методы природы. 13 (3): 269–275. Дои:10.1038 / nmeth.3742. ISSN  1548-7091. ЧВК  4767631. PMID  26808670.