SnRNA-seq - SnRNA-seq

snRNA-seq, также известный как одноядерное секвенирование РНК, одноядерное секвенирование РНК или sNuc-seq, является Секвенирование РНК метод профилирования экспрессия гена в клетки которые трудно изолировать, например из тканей, которые заархивированы или которые трудно отделить. Это альтернатива последовательность одноклеточной РНК (scRNA-seq), поскольку он анализирует ядра вместо целых клеток.

snRNA-seq сводит к минимуму возникновение ложной экспрессии генов, поскольку локализация полностью зрелых рибосомы к цитоплазма означает, что любой мРНК из факторы транскрипции которые экспрессируются после процесса диссоциации, не могут транслироваться, и, следовательно, их нижележащие мишени не могут быть транскрибированы.[1]. Кроме того, технология snRNA-seq позволяет открывать новые типы клеток, которые иначе было бы сложно выделить.

Методы и технологии

Базовый метод snRNA-seq требует 4 основных этапа: обработка ткани, выделение ядер, сортировка клеток и секвенирование. Для выделения и секвенирования РНК внутри ядра snRNA-seq включает использование протокола быстрой и мягкой диссоциации ядра. Этот протокол позволяет свести к минимуму технические проблемы, которые могут повлиять на исследования, особенно связанные с немедленный ранний ген (IEG) поведение.

Полученные диссоциированные клетки суспендируют и суспензию осторожно лизируют, что позволяет отделить ядра клеток от их цитоплазматических лизатов с помощью центрифугирования.[2]. Эти разделенные ядра / клетки сортируются с помощью FACS в отдельные лунки и амплифицируются с помощью микрофлюидного оборудования.[2]. Секвенирование происходит как обычно, и данные можно анализировать в зависимости от их использования. Эта базовая методология snRNA-seq способна профилировать РНК из тканей, которые сохранены или не могут быть диссоциированы, но она не обладает высокой пропускной способностью из-за ее зависимости от сортировки ядер с помощью FACS.[3]. Этот метод нельзя легко масштабировать для профилирования большого количества ядер или образцов. Существуют массивно параллельные методы scRNA-seq, и их можно легко масштабировать, но их потребность в единственной клеточной суспензии в качестве входных данных не идеальна и устраняет некоторую гибкость, которая доступна с методом snRNA-seq в отношении типов тканей и клеток, которые можно изучить[3]. В ответ на это исследователи из Института Броуда при Массачусетском технологическом институте и Гарварда разработали метод DroNc-Seq массового параллелизма snRNA-seq с капельной технологией.[3]. В этом методе ядра, которые были выделены из фиксированной или замороженной ткани, инкапсулируются в капли с гранулами с уникальным штрих-кодом, которые покрыты олигонуклеотидами, содержащими 30-концевой дезокситиминовый (dT) отрезок.[4]. Это покрытие улавливает содержание полиаденилированной мРНК, образующейся при лизировании ядер внутри капель.[4]. Захваченная мРНК подвергается обратной транскрипции в кДНК после разрушения эмульсии.[4]. Секвенирование этой кДНК дает транскриптомы всех исследуемых отдельных ядер, и их можно использовать для многих целей, включая идентификацию уникальных типов клеток.[5].

Инструменты и оборудование для секвенирования, используемые в scRNA-seq, могут использоваться с модификациями для экспериментов с snRNA-seq. Illumina описывает рабочий процесс для основного метода snRNA-seq, который может быть выполнен с существующим оборудованием.[2]. DroNc-Seq может быть реализован с помощью микрофлюидных платформ, которые предназначены для метода Drop-seq scRNA-seq. Тем не менее, Dolomite Bio адаптировала один из своих инструментов, автоматизированную платформу Nadia для scRNA-seq, которая также будет использоваться изначально для DroNc-Seq.[5]. Этот инструмент может упростить создание библиотек для секвенирования отдельных ядер, поскольку он используется по прямому назначению.

Что касается анализа данных после секвенирования, то вычислительный конвейер, известный как dropSeqPipe, был разработан лабораторией МакКэрролла в Гарварде.[6]. Хотя конвейер изначально был разработан для использования с данными Drop-seq scRNA-seq, он может использоваться с данными DroNc-Seq, поскольку он также использует капельную технологию.

Разница между snRNA-seq и scRNA-seq

snRNA-seq использует изолированные ядра вместо целых клеток для профилирования экспрессии генов. Другими словами, scRNA-seq измеряет как цитоплазматические, так и ядерные транскрипты, тогда как snRNA-seq в основном измеряет ядерные транскрипты (хотя некоторые транскрипты могут быть прикреплены к грубому эндоплазматическому ретикулуму и частично сохранены в ядерных препаратах)[7]. Это позволяет snRNA-seq действовать только в ядре, а не во всей клетке. По этой причине, по сравнению с scRNA-seq, snRNA-Seq более подходит для профилирования экспрессии генов в клетках, которые трудно выделить (например, адипоциты, нейроны), а также в сохраненных тканях.[5].

Кроме того, ядра, необходимые для snRNA-seq, можно быстро и легко получить из свежих, слегка фиксированных или замороженных тканей, тогда как выделение отдельных клеток для одноклеточной RNA-seq (scRNA-seq) включает длительные инкубации и обработку. Это дает исследователям возможность получать транскриптомы, которые не изменяются во время изоляции.

Заявление

В нейробиологии нейроны имеют взаимосвязанную природу, что чрезвычайно затрудняет выделение целых отдельных нейронов.[8]. Поскольку snRNA-seq стала альтернативным методом оценки транскриптома клетки путем выделения отдельных ядер, стало возможным проводить исследования отдельных нейронов из посмертной ткани мозга человека.[9]. snRNA-seq также позволил провести первый одиночный нейронный анализ экспрессии немедленных ранних генов (IEG), связанных с формированием памяти в гиппокампе мыши.[1]. В 2019 году Дмитрий и др. Использовали этот метод на кортикальной ткани пациентов с РАС для выявления транскриптомных изменений, связанных с РАС, в определенных типах клеток, что является первой оценкой транскриптома, специфичной для определенного типа клеток, в мозге, пораженном РАС.[10].

Помимо нейробиологии, snRNA-seq также используется в других областях исследований. В 2019 году Haojia et al сравнили как scRNA-seq, так и snRNA-seq в геномном исследовании вокруг почек. Они обнаружили, что snRNA-seq обеспечивает такую ​​же скорость обнаружения генов, что и scRNA-seq в почках взрослого человека с рядом значительных преимуществ (включая совместимость с замороженными образцами, снижение систематической ошибки диссоциации и т. Д.).[11]. В 2019 году Джоши и др. Использовали snRNA-seq в исследовании биологии легких человека, в котором они обнаружили, что snRNA-seq позволяет беспристрастно идентифицировать типы клеток из замороженных здоровых и фиброзных тканей легких.[12]. Ткань сердца взрослых млекопитающих может быть чрезвычайно трудно диссоциировать без повреждения клеток, что не позволяет легко секвенировать ткань. Однако в 2020 году немецкие ученые представили первый отчет о секвенировании сердца взрослого млекопитающего с использованием snRNA-seq и смогли предоставить практическое распределение типов клеток в сердце.[13]

Плюсы и минусы snRNA-seq

Плюсы

  1. В scRNA-seq процесс диссоциации может повредить некоторые чувствительные клетки и некоторые клетки в определенных тканях (например, коллагеновый матрикс[11]) может быть чрезвычайно трудно отделить. Такие проблемы можно предотвратить с помощью snRNA-seq, поскольку нам нужно изолировать только одно ядро, а не целую клетку.
  2. В отличие от scRNA-seq, snRNA-seq имеет протоколы быстрой и мягкой диссоциации ядер, которые предотвращают технические проблемы, возникающие из-за нагревания, переваривания протеазами и ложной экспрессии генов, вызванных цитоплазматическими рибосомами.[2]
  3. snRNA-seq очень хорошо работает для консервированных / замороженных тканей.[5]

Минусы

  1. Секвенирование РНК в цитоплазме (изоформы генов, РНК в митохондриях, хлоропластах и ​​т. Д.) Невозможно, поскольку snRNA-seq в основном измеряет ядерные транскрипты.

Рекомендации

  1. ^ а б Лакар, Бенджамин; Линкер, Сара Б .; Jaeger, Baptiste N .; Кришнасвами, Сугуна; Бэррон, Джерика; Келдер, Мартейн; Парилак, Сара; Пакула, Апуа; Венепалли, Пратап; Новотный, Марк; О'Коннор, Кэролин (19 апреля 2016 г.). «Ядерная РНК-последовательность отдельных нейронов выявляет молекулярные признаки активации». Nature Communications. 7: 11022. Bibcode:2016НатКо ... 711022L. Дои:10.1038 / ncomms11022. ISSN  2041-1723. ЧВК  4838832. PMID  27090946.
  2. ^ а б c d «мяРНК-Seq». www.illumina.com. Получено 2020-02-28.
  3. ^ а б c Хабиб, Наоми; Авраам-Давиди, Инбал; Басу, Аниндита; Беркс, Тайлер; Шекхар, Картик; Хофри, Матан; Choudhury, Sourav R .; Агуэ, Франсуа; Гельфанд, Эллен; Ардли, Кристин; Вайц, Дэвид А. (октябрь 2017 г.). «Массивно-параллельная одноядерная последовательность РНК с DroNc-seq». Природные методы. 14 (10): 955–958. Дои:10.1038 / nmeth.4407. ISSN  1548-7105. ЧВК  5623139. PMID  28846088.
  4. ^ а б c F, J (7 ноября 2018 г.). «Высокопроизводительный анализ одиночных транскриптомов ядер с помощью инструмента Nadia от Dolomite Bio» (PDF). Доломит Био. Получено 27 февраля, 2020.
  5. ^ а б c d Био, Доломит. «Одноядерная РНК-Seq (sNuc-Seq)». Доломит Био. Получено 2020-02-27.
  6. ^ Macosko, Evan Z .; Басу, Аниндита; Сатия, Рахул; Немеш, Джеймс; Шекхар, Картик; Гольдман, Мелисса; Тирош, Итай; Bialas, Allison R .; Камитаки, Нолан; Martersteck, Emily M .; Тромбетта, Джон Дж. (21 мая 2015 г.). «Профилирование экспрессии индивидуальных клеток с высокой степенью параллельности генома с использованием капель нанолитера». Клетка. 161 (5): 1202–1214. Дои:10.1016 / j.cell.2015.05.002. ISSN  0092-8674. ЧВК  4481139. PMID  26000488.
  7. ^ Баккен, Тригве Э .; Ходж, Ребекка Д.; Миллер, Джереми А .; Яо, Цзычжэнь; Нгуен, Тхук Нги; Эйверманн, Брайан; Баркан, Элиза; Бертаньолли, Даррен; Каспер, Тамара; Ди, Ник; Гаррен, Эмма (26 декабря 2018 г.). «Одноядерные и одноклеточные транскриптомы по сравнению с подобранными типами корковых клеток». PLOS ONE. 13 (12): e0209648. Bibcode:2018PLoSO..1309648B. Дои:10.1371 / journal.pone.0209648. ISSN  1932-6203. ЧВК  6306246. PMID  30586455.
  8. ^ Lake, Blue B .; Коделуппи, Симона; Yung, Yun C .; Гао, Дерек; Чун, Джерольд; Харченко, Петр В .; Линнарссон, Стен; Чжан, Кун (20.07.2017). «Сравнительная стратегия для одноядерных и одноклеточных транскриптомов подтверждает точность предсказанной экспрессии клеточного типа на основе ядерной РНК». Научные отчеты. 7 (1): 6031. Bibcode:2017НатСР ... 7.6031Л. Дои:10.1038 / s41598-017-04426-w. ISSN  2045-2322. ЧВК  5519641. PMID  28729663.
  9. ^ Кришнасвами, Сугуна Рани; Гриндберг, Рашель В .; Новотный, Марк; Венепалли, Пратап; Лакар, Бенджамин; Бутани, Кунал; Линкер, Сара Б .; Фам, сын; Эрвин, Дженнифер А .; Миллер, Джереми А .; Ходж, Ребекка (март 2016 г.). «Использование отдельных ядер для RNA-seq для захвата транскриптома посмертных нейронов». Протоколы природы. 11 (3): 499–524. Дои:10.1038 / nprot.2016.015. ISSN  1750-2799. ЧВК  4941947. PMID  26890679.
  10. ^ Велмешев Дмитрий; Ширмер, Лукас; Юнг, Дайан; Хаусслер, Максимилиан; Перес, Йонатан; Майер, Симона; Бхадури, Апарна; Гоял, Ниташа; Роуитч, Дэвид Х .; Кригштейн, Арнольд Р. (17 мая 2019 г.). «Одноклеточная геномика определяет молекулярные изменения, характерные для определенного типа клеток при аутизме». Наука. 364 (6441): 685–689. Дои:10.1126 / science.aav8130. ISSN  0036-8075. PMID  31097668. S2CID  156055368.
  11. ^ а б У, Хаоцзя; Кирита, Юхей; Donnelly, Erinn L .; Хамфрис, Бенджамин Д. (январь 2019 г.). «Преимущества одноядерного секвенирования РНК взрослой почки над одноклеточной: при фиброзе выявлены редкие типы клеток и новые состояния клеток». Журнал Американского общества нефрологов. 30 (1): 23–32. Дои:10.1681 / ASN.2018090912. ISSN  1046-6673. ЧВК  6317600. PMID  30510133.
  12. ^ Joshi, N .; Watanabe, S .; Reyfman, P.a .; Bharat, A .; Budinger, G.s .; Мишарин, А. (2019-05-01), "Single Nuclei RNA-Seq для объективного подсчета типов клеток в архивных замороженных тканях легких человека", D29. МУЛЬТИОМИКА ЛЕГКИХ К МЕХАНИЗМУ, Тезисы докладов Международной конференции Американского торакального общества, Американское торакальное общество, стр. A6077, Дои:10.1164 / ajrccm-conference.2019.199.1_meetingabstracts.a6077
  13. ^ Вольфьен, Маркус; Галоу, Энн-Мари; Мюллер, Паула; Барч, Мадлен; Бруннер, Рональд М .; Голдаммер, Том; Волькенхауэр, Олаф; Хёфлих, Андреас; Дэвид, Роберт (февраль 2020 г.). "Одноядерное секвенирование всего сердца млекопитающего: состав и скорость клеточного типа". Клетки. 9 (2): 318. Дои:10.3390 / ячейки9020318. ЧВК  7072447. PMID  32013057.