Электронная криотомография - Electron cryotomography

На этой схеме показана концепция электронной томографии. Образец отображается в ПЭМ, поскольку он наклонен под разными углами, что приводит к «серии наклона» 2D-изображений (вверху). Затем эта серия наклона с помощью вычислений преобразуется в трехмерную «томограмму» (внизу).

Электронная криотомография (КриоЭТ) - это метод визуализации, используемый для получения трехмерных изображений образцов с высоким разрешением (~ 1–4 нм), обычно биологических. макромолекулы и клетки.[1][2] CryoET - это специализированное приложение трансмиссионная электронная криомикроскопия (CryoTEM), в котором образцы отображаются под наклоном, в результате чего получается серия 2D-изображений, которые можно объединить для создания 3D-реконструкции, аналогичной компьютерная томография человеческого тела. В отличие от других электронная томография методы, образцы иммобилизуют в некристаллическом («стекловидном») льду и визуализируют под криогенный условиях (<-150 ° C), что позволяет получать изображения без обезвоживания или химической фиксации, которые в противном случае могли бы нарушить или исказить биологические структуры.[3][4]

Описание техники

Пример электронной криотомографии. На изображении показан центральный срез после томографической реконструкции неповрежденного Bdellovibrio bacteriovorus клетка. Масштабная шкала 200 нм.

В электронная микроскопия (EM) образцы визуализируются в сверхвысоком вакууме. Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода закипит, и при перепаде давления ячейка взорвется. Поэтому в методах ЭМ при комнатной температуре образцы готовят путем фиксации и обезвоживания. Однако другой подход к стабилизации биологических образцов - их замораживание (электронная криомикроскопия ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для CryoET (обычно небольшие ячейки (например, Бактерии, Археи, или же вирусы ) готовят в стандартных водных средах и наносят на ЭМ сетку. Затем сетка погружается в криоген (обычно этан ) настолько эффективен, что воды молекулы не успели переставить в кристаллический решетка.[3] Получающееся в результате состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет естественные клеточные структуры, такие как липидные мембраны, который обычно уничтожается замораживанием. Образцы, замороженные погружением, впоследствии хранятся и визуализируются в жидкий азот температуры, так что вода никогда не нагревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы изображены в просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА). Как и в других электронная томография При использовании техники образец наклоняют под разными углами относительно электронного луча (обычно каждые 1 или 2 градуса от примерно -60 ° до + 60 °), и изображение получают под каждым углом. Затем эту серию изображений с наклоном можно реконструировать с помощью вычислений в трехмерное изображение интересующего объекта.[5] Это называется томограммой или томографической реконструкцией.

Приложения

В просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом, разрешение ограничено толщиной образца. Кроме того, толщина образца увеличивается по мере того, как образец наклоняется, и более толстые образцы могут полностью блокировать электронный луч, делая изображение темным или полностью черным. Следовательно, для CryoET образцы должны иметь толщину менее ~ 500 нм для достижения «макромолекулярного» разрешения (~ 4 нм). По этой причине большинство исследований ЭСТ было сосредоточено на очищенных макромолекулярных комплексах, вирусах или малых клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей.[1]

Более крупные клетки и даже ткани могут быть подготовлены для CryoET путем их истончения, криосрезов или сфокусированный ионный пучок (FIB) фрезерование. При криосрезе замороженные блоки клеток или ткани делятся на тонкие образцы с помощью криосрезов.микротом.[6] При фрезеровании FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного пучка ионов, обычно галлия, который точно удаляет материал с верхней и нижней части образца, оставляя тонкую пластинку, пригодную для визуализации ЭСТ.[7]

Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с относительно большей площадью поперечного сечения при более высоких углах наклона. На практике углы наклона более 60–70 ° не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «отсутствующему клину» информации на окончательной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному пучку.[5]

Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) может быть получено путем усреднения субтомограмм.[8][9] Похожий на анализ отдельных частиц, усреднение субтомограммы вычислительно объединяет изображения идентичных объектов для увеличения соотношение сигнал шум.

Основным препятствием в CryoET является идентификация интересующих структур в сложных клеточных средах. Одним из решений является применение коррелированных крио-флуоресцентная световая микроскопия,[10] и даже световая микроскопия сверхвысокого разрешения (например, крио-ладони[11]) и CryoET. В этих методиках образец, содержащий интересующий флуоресцентно-меченый белок, замораживают и сначала визуализируют в световом микроскопе, оборудованном специальным предметным столиком, позволяющим хранить образец при температурах субкристаллизации (<-150 ° C). Расположение флуоресцентный сигнал идентифицируется, и образец передается в CryoTEM, где то же место затем отображается с высоким разрешением с помощью CryoET.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Ган, Лу; Дженсен, Грант Дж. (01.02.2012). «Электронная томография клеток» (PDF). Ежеквартальные обзоры биофизики. 45 (1): 27–56. Дои:10.1017 / S0033583511000102. ISSN  1469-8994. PMID  22082691.
  2. ^ Додонова Светлана О; Адерхолд, Патрик; Копп, Юрген; Ганева, Ива; Рёлинг, Симона; Hagen, Wim JH; Грех, Ирмгард; Виланд, Феликс; Бриггс, Джон А.Г. (16.06.2017). «Структура 9Å оболочки COPI показывает, что ГТФаза Arf1 занимает два контрастирующих молекулярных окружения». eLife. 6. Дои:10.7554 / eLife.26691. ISSN  2050-084X. ЧВК  5482573. PMID  28621666.
  3. ^ а б Dubochet, J .; Адриан, М .; Chang, J. J .; Homo, J. C .; Lepault, J .; McDowall, A.W .; Шульц, П. (1988-05-01). «Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов» (PDF). Ежеквартальные обзоры биофизики. 21 (2): 129–228. Дои:10.1017 / s0033583500004297. ISSN  0033-5835. PMID  3043536.
  4. ^ Oikonomou, CM; Jensen, GJ; Чанг, Ю.В. (апрель 2016 г.). «Новый взгляд на биологию прокариотических клеток с помощью электронной криотомографии». Обзоры природы. Микробиология. 14 (4): 205–20. Дои:10.1038 / nrmicro.2016.7. ЧВК  5551487. PMID  26923112.
  5. ^ а б Лучич, Владан; Ригорт, Александр; Баумейстер, Вольфганг (05.08.2013). «Криоэлектронная томография: проблема структурной биологии на месте». Журнал клеточной биологии. 202 (3): 407–419. Дои:10.1083 / jcb.201304193. ISSN  1540-8140. ЧВК  3734081. PMID  23918936.
  6. ^ Аль-Амуди, Ашраф; Чанг, Цзинь-Джу; Лефорстье, Амели; Макдауэл, Аласдер; Саламин, Лоре Мишель; Норлен, Ларс П. О .; Рихтер, Карстен; Блан, Натали Сартори; Студер, Дэниел (2004-09-15). «Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела». Журнал EMBO. 23 (18): 3583–3588. Дои:10.1038 / sj.emboj.7600366. ISSN  0261-4189. ЧВК  517607. PMID  15318169.
  7. ^ Вилла, Елизавета; Шаффер, Мирослава; Плитцко, Юрген М .; Баумейстер, Вольфганг (01.10.2013). «Открытие окон в ячейке: фрезерование сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии». Текущее мнение в структурной биологии. 23 (5): 771–777. Дои:10.1016 / j.sbi.2013.08.006. ISSN  1879-033X. PMID  24090931.
  8. ^ Бриггс, Джон А. Г. (2013-04-01). «Структурная биология in situ - возможности усреднения субтомограмм». Текущее мнение в структурной биологии. 23 (2): 261–267. Дои:10.1016 / j.sbi.2013.02.003. ISSN  1879-033X. PMID  23466038.
  9. ^ Schur, Florian K. M .; Дик, Роберт А .; Hagen, Wim J. H .; Vogt, Volker M .; Бриггс, Джон А. Г. (2015-10-15). «Структура незрелых вирусоподобных частиц вируса саркомы Рауса раскрывает структурную роль домена p10 в сборке». Журнал вирусологии. 89 (20): 10294–10302. Дои:10.1128 / JVI.01502-15. ISSN  1098-5514. ЧВК  4580193. PMID  26223638.
  10. ^ Чжан, Пэйцзюнь (01.10.2013). «Корреляционная криоэлектронная томография и оптическая микроскопия клеток». Текущее мнение в структурной биологии. 23 (5): 763–770. Дои:10.1016 / j.sbi.2013.07.017. ISSN  1879-033X. ЧВК  3812453. PMID  23962486.
  11. ^ Чанг, И-Вэй; Чен, Сонгье; Точева, Елица И .; Treuner-Lange, Anke; Лёбах, Стефани; Согаард-Андерсен, Лотте; Дженсен, Грант Дж. (01.07.2014). «Коррелированная криогенная фотоактивированная локализационная микроскопия и криоэлектронная томография». Методы природы. 11 (7): 737–739. Дои:10.1038 / nmeth.2961. ISSN  1548-7105. ЧВК  4081473. PMID  24813625.

внешняя ссылка