Зависимая от геликазы амплификация - Helicase-dependent amplification

Зависимая от геликазы амплификация (HDA) - это метод для in vitro ДНК усиление (как полимеразной цепной реакции ), которое происходит при постоянной температуре.

Вступление

Полимеразная цепная реакция - наиболее широко используемый метод in vitro Амплификация ДНК для целей молекулярной биологии и биомедицинских исследований.[1] Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одноцепочечные (этап денатурации, обычно достигается при 95–97 ° C), отжиг праймеров до одноцепочечной ДНК (этап отжига) и копирование одноцепочечной ДНК. цепей для создания новой двухцепочечной ДНК (этап удлинения, который требует ДНК-полимеразы) требует, чтобы реакция проводилась в термоциклер. Эти настольные машины большие, дорогие и дорогостоящие в эксплуатации и обслуживании, что ограничивает потенциальные применения амплификации ДНК в ситуациях за пределами лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте исследования или в момент исследования). ухода за пациентом). Хотя ПЦР обычно ассоциируется с термоциклированием, исходный патент Mullis et al. [2] раскрыли использование геликазы как средства денатурации двухцепочечной ДНК, включая изотермическую амплификацию нуклеиновой кислоты.В естественных условияхДНК реплицируется ДНК-полимеразами с различными вспомогательными белками, включая ДНК-геликазу, которая разделяет ДНК, раскручивая двойную спираль ДНК.[3] HDA был разработан на основе этой концепции с использованием геликаза (ан фермент ) денатурировать ДНК.

Методология

Нити двухцепочечной ДНК сначала разделяются ДНК-геликазой и покрываются белками, связывающими одноцепочечную ДНК (оцДНК). На втором этапе два праймера, специфичных для последовательности, гибридизуются с каждой границей ДНК-матрицы. Затем ДНК-полимеразы используются для удлинения праймеров, отожженных до матриц, для получения двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем используются в качестве субстратов для ДНК-геликаз, вступая в следующий раунд реакции. Таким образом, одновременно развивается цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной целевой последовательности (см. Vincent и другие.., 2004[4] для принципиальной схемы).

Настоящий прогресс, а также преимущества и недостатки HDA

С момента публикации своего открытия технология HDA используется для «простого, легко адаптируемого теста на нуклеиновую кислоту для обнаружения Clostridium difficile".[5] Другие приложения включают быстрое обнаружение Золотистый стафилококк путем амплификации и обнаружения короткой последовательности ДНК, специфичной для бактерии.[6] Преимущества HDA заключаются в том, что он обеспечивает быстрый метод амплификации нуклеиновой кислоты конкретной мишени при изотермической температуре, не требующий термоциклера. Однако исследователю необходимо заранее оптимизировать праймеры, а иногда и буферы. Обычно оптимизация праймера и буфера проверяется и достигается с помощью ПЦР, что ставит вопрос о необходимости дополнительных затрат на отдельную систему для проведения фактической амплификации. Несмотря на то, что HDA отрицает использование термоциклера и, следовательно, позволяет проводить исследования в полевых условиях, большая часть работы, необходимой для обнаружения потенциально опасных микроорганизмов, независимо от этого выполняется в условиях исследовательской / больничной лаборатории. В настоящее время массовая диагностика большого количества образцов с помощью HDA еще не может быть достигнута, тогда как реакции ПЦР, проводимые в термоциклер который может содержать многолуночные планшеты для образцов, позволяет амплификацию и обнаружение намеченной ДНК-мишени максимум из 96 образцов. Стоимость приобретения реагентов для HDA также относительно высока по сравнению с реагентами для ПЦР, тем более что они поставляются в виде готового набора.

внешняя ссылка

Рекомендации

  1. ^ Сайки Р.К. и др. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Наука. 239 (4839): 487–491. Дои:10.1126 / science.239.4839.487. PMID  2448875.
  2. ^ [1] 
  3. ^ Корнберг А., Бейкер Т. (1992). Репликация ДНК, 2-е изд.. WH Freeman and Company: Нью-Йорк. ISBN  978-1-891389-44-3.
  4. ^ Винсент М., Сюй И, Конг Х (2004). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК». EMBO Rep. 5 (8): 795–800. Дои:10.1038 / sj.embor.7400200. ЧВК  1249482. PMID  15247927.
  5. ^ Чоу WH, Макклоски C, Тонг Y, Ху L, You Q, Келли CP, Kong H, Tang YW, Tang W. (2008). «Применение изотермической геликазозависимой амплификации с одноразовым устройством обнаружения в простом чувствительном тесте стула на токсигенный Clostridium difficile». Дж Мол Диаг. 10 (5): 452–8. Дои:10.2353 / jmoldx.2008.080008. ЧВК  2518740. PMID  18669881.[постоянная мертвая ссылка ]
  6. ^ «Набор для быстрого обнаружения стафилококка IsoAmp (описание продукта)». Biohelix corp. Архивировано из оригинал на 2009-10-10.