Анализ гибридизации - Hybridization assay

А гибридизационный анализ включает любую форму поддающейся количественной оценке гибридизации т.е. количественный отжиг двух дополнительных нитей нуклеиновых кислот, известный как гибридизация нуклеиновых кислот.[1]

Обзор

В контексте биохимии и разработки лекарств гибридизационный анализ представляет собой тип Анализ связывания лиганда (LBA) используется для количественного определения нуклеиновых кислот в биологических матрицах. Анализы гибридизации могут проводиться в растворе или на твердом носителе, таком как 96-луночные планшеты или меченые шарики.

Анализы гибридизации включают меченые зонды нуклеиновых кислот для идентификации родственных ДНК или РНК молекулы (то есть со значительно высокой степенью сходства последовательностей) в сложной смеси немеченых нуклеиновая кислота молекулы. Антисмысловая терапия, миРНК, и другие олигонуклеотид и на основе нуклеиновых кислот биотерапия можно количественно оценить с помощью анализов гибридизации.

Сигнализация методов гибридизации может быть выполнена с использованием олигонуклеотидных зондов, модифицированных в процессе синтеза с помощью гаптены и малая молекула лиганды которые действуют гомологично улавливающим и детектирующим антителам. Как и в случае с традиционными ELISA, конъюгаты с пероксидазой хрена (HRP) или щелочная фосфатаза (AP) можно использовать в качестве вторичных антител.

Сэндвич-гибридизационный анализ

Сэндвич-гибридизационный анализ

В сэндвич-гибридизации ELISA В формате анализа антиген-лиганд и антитела в ELISA заменяются анализируемым веществом нуклеиновой кислоты, комплементарными зондами для захвата и обнаружения олигонуклеотидов.[2]

Как правило, в случае гибридизации нуклеиновой кислоты концентрацию одновалентной соли и температуру контролируют для гибридизации и строгости отмывки, в отличие от традиционного ELISA, где концентрация соли обычно фиксируется для стадий связывания и отмывки (то есть PBS или TBS). Таким образом, оптимальная концентрация соли в анализах гибридизации варьируется в зависимости от длины и основного состава анализируемого вещества, зондов захвата и обнаружения.

Конкурентный анализ гибридизации

Конкурентный анализ гибридизации[3] похож на традиционный конкурентный иммуноферментный анализ. Как и другие методы гибридизации, он основан на комплементарности, когда зонд захвата конкурирует между аналитом и индикатором - меченым аналогом олигонуклеотида аналиту.

Анализ гибридизации-лигирования

В анализе гибридизации-лигирования[4][5] зонд-шаблон заменяет зонд захвата в сэндвич-анализе для иммобилизации на твердой подложке. Матричный зонд полностью комплементарен олигонуклеотидному аналиту и предназначен для использования в качестве субстрата для ДНК-лигаза Т4 -опосредованная перевязка. Зонд-шаблон имеет, кроме того, дополнительное растяжение, комплементарное зонду лигирования, так что зонд лигирования будет лигировать на 3'-конец аналита. Зонд лигирования, хотя и является общим, похож на зонд обнаружения в том, что он помечен, например, дигоксигенином для передачи сигналов ниже по течению. Строгая промывка с низким содержанием соли или без соли удалит не лигированные продукты.

Связывание анализируемого вещества с зондом лигирования делает метод специфичным для 3'-конца анализируемого вещества, лигирование ДНК-лигазой Т4 намного менее эффективно по петле выпуклости, что могло бы произойти для 3'-версии метаболита N-1 аналит, например. Специфичность анализа гибридизации-лигирования для лигирования на 3'-конце особенно важна, потому что преобладающие нуклеазы в крови составляют от 3 'до 5'. экзонуклеазы.

Одним из ограничений метода является то, что он требует свободного 3'-концевого гидроксила, который может быть недоступен, если, например, к 3'-концу присоединены целевые фрагменты. Кроме того, более экзотический химический состав нуклеиновых кислот с олигонуклеотидными лекарственными средствами может влиять на активность лигазы, которую необходимо определять в каждом конкретном случае.

Анализ гибридизации с двойным лигированием

Анализ гибридизации с двойным лигированием

Анализ гибридизации с двойным лигированием (DLA)[6] расширяет специфичность анализа гибридизации-лигирования до конкретного метода для исходного соединения. Несмотря на надежность, чувствительность и дополнительную специфичность анализа гибридизации-лигирования для 3'-конца олигонкулеотидного аналита, анализ гибридизации-лигирования не специфичен для 5'-конца аналита.

DLA предназначен для количественного определения только полноразмерного исходного олигонуклеотидного соединения с интактными 5 'и 3' концами. Зонды DLA лигируют на 5 'и 3' концах анализируемого вещества за счет совместного действия ДНК-лигаза Т4 и Полинуклеотидкиназа Т4. Киназа фосфорилирует 5'-конец анализируемого вещества, и лигаза присоединяет зонд захвата к аналиту и зонду обнаружения. Таким образом, зонды захвата и обнаружения в DLA можно назвать зондами лигирования. Что касается анализа гибридизации-лигирования, DLA специфичен для исходного соединения, потому что эффективность лигирования над петлей выпуклости низкая, и, таким образом, DLA обнаруживает полноразмерный аналит с интактными 5 'и 3'-концами. DLA также можно использовать для определения индивидуальных метаболитов в биологических матрицах.

Ограничения анализа гибридизации-лигирования также применимы к анализу двойного лигирования, где 5'-конец в дополнение к 3'-концу требует наличия свободного гидроксила (или фосфатной группы). Кроме того, ДНК-лигазы Т4 несовместимы с лигированием молекул РНК в качестве донора (т.е. РНК на 5'-конце лигирования). Поэтому второе поколение антисмысловой которые содержат 2'-O-метил РНК, 2'-O-метоксиэтил или заблокированные нуклеиновые кислоты, могут быть несовместимы с анализом двойного лигирования.

Анализ гибридизации нуклеаз

Анализ гибридизации нуклеаз

Анализ нуклеазной гибридизации,[7][8] также называется Нуклеаза S1 пробирной резки, является анализ защиты от нуклеаз гибридизация на основе ELISA. Анализ использует Нуклеаза S1, который расщепляет одноцепочечные ДНК и РНК на олиго- или мононуклеотиды, оставляя интактными двухцепочечные ДНК и РНК.

В анализе нуклеазной гибридизации олигонуклеотидный аналит захватывается твердой подложкой, такой как 96-луночный планшет, с помощью полностью комплементарного режущего зонда. После ферментативной обработки нуклеазой S1 свободный режущий зонд и режущий зонд гибридизировались с метаболитами, т.е. короткоживущие вещества анализируемого вещества разлагаются, что позволяет генерировать сигнал только от полноразмерного дуплекса зонда и анализируемого вещества.

Анализ хорошо толерантен к различным химическим веществам, что подтверждается разработкой нуклеазного анализа для морфолино олигонуклеотиды.[9]

Эта установка для анализа может быть недостаточно надежной и не подходит для проверки в соответствии с рекомендациями FDA для валидация биоаналитического метода. Об этом свидетельствует отсутствие опубликованных методов, которые были утверждены на соответствие стандартам, установленным FDA для биоаналитических методов.

использованная литература

  1. ^ Ким, Калицис, джи хун, пол; и другие. «Нуклеиновые кислоты: гибридизация». хитрый. Получено 4 февраля 2017.
  2. ^ Efler, S.M .; Zhang, L .; Noll, B.O .; Uhlmann, E .; Дэвис, Х.Л. (2005), «Количественная оценка олигодезоксинуклеотидов в плазме человека с помощью нового гибридизационного анализа предлагает значительно более высокую чувствительность по сравнению с электрофорезом в капиллярном геле», Олигонуклеотиды, 15 (2): 119–131, Дои:10.1089 / oli.2005.15.119, PMID  15989426
  3. ^ Деверре, Жан-Робер; Буте, Валери; Боке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Грогне, Жан-Марк (1997), «Конкурентный анализ ферментной гибридизации для определения в плазме фосфодиэфирных и фосфоротиоатных антисмысловых олигонуклеотидов», Исследования нуклеиновых кислот, 25 (18): 3584–3589, Дои:10.1093 / nar / 25.18.3584, ЧВК  146941, PMID  9278477
  4. ^ Деверре, Жан-Робер; Буте, Валери; Боке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Грогне, Жан-Марк (1997), «Конкурентный анализ ферментной гибридизации для определения в плазме фосфодиэфирных и фосфоротиоатных антисмысловых олигонуклеотидов», Исследования нуклеиновых кислот, 25 (18): 3584–3589, Дои:10.1093 / nar / 25.18.3584, ЧВК  146941, PMID  9278477
  5. ^ B1 Патент США 6355438 B1 Бренда Ф. Бейкер; Чжэнронг Ю. и Джанет М. Лидс, "Метод количественного определения олигонуклеотидов", опубликовано 12 марта 2002 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc. 
  6. ^ Tremblay, Guy A .; Халафагян, Гарине; Лего, Джули; Бартлетт, Алан (март 2011 г.), «Анализ гибридизации с двойным лигированием для специфического определения олигонуклеотидных терапевтических средств», Биоанализ, 3 (5): 499–508, Дои:10.4155 / bio.11.18, PMID  21388263
  7. ^ Патент США 8163477, Чжэнжун Юй; Бренда Ф. Бейкер и Хунцзян Ву, "Метод на основе нуклеаз для обнаружения и количественного определения олигонуклеотидов", опубликовано 24 апреля 2012 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc. 
  8. ^ Сяохуэй, Вэй; Дай, Гуовэй; Маркучи, Гвидо; Лю, Чжунфа; Хойт, Дейл; Блюм, Уильям; Чан, Кеннет К. (2006), «Анализ ELISA на основе специфической пикомолярной гибридизации для определения фосфоротиоатных олигонуклеотидов в плазме и клеточном матриксе», Фармацевтические исследования, 23 (6): 1251–1264, Дои:10.1007 / s11095-006-0082-3, PMID  16718617
  9. ^ Бурки, Умар; Кин, Джонатан; Блейн, Элисон; О'Донован, Лиз; Походка, Майкл Дж .; Лаваль, Стивен Х .; Straub, Volker (2015), "Разработка и применение метода ELISA на основе сверхчувствительной гибридизации для определения конъюгированных с пептидами морфолиноолигонуклеотидов фосфодиамидата", Нуклеиновые кислоты, 25 (5): 275–284, Дои:10.1089 / нац.2014.0528, ЧВК  4576940, PMID  26176274