Иммуноэлектрофорез - Immunoelectrophoresis

Кросс-иммуноэлектрофорез 2 мкл нормальной сыворотки человека. Электрофорез проводили в тонких слоях агарозы, размер геля на фото около 7x7 см. Нижняя часть представляет собой гель первого измерения без антител, в котором сыворотка вводилась в щель в нижнем левом углу. Верхняя часть представляет собой гель второго измерения с антителами Дако против белков сыворотки крови человека. Можно назвать более 50 основных белков сыворотки.
Иммуноэлектрофорез иммуноэлектрофореза аффинной хроматографии белков сыворотки крови человека на con A. Наносят образец объемом 15 микролитров из каждой фракции (начиная слева) и оставляют для диффузии примерно в течение часа, затем в течение ночи проводят электрофорез. Пик «а» не сохраняется, пик «b» сохраняется и элюируется метилманнозой, стрелка указывает на белки, которые незначительно удерживаются сомом.

Иммуноэлектрофорез - общее название ряда биохимических методов разделения и характеристики белки на основе электрофорез и реакция с антитела. Все варианты иммуноэлектрофореза требуют иммуноглобулины, также известный как антитела, реагируя с белками, которые необходимо разделить или охарактеризовать. Эти методы были разработаны и широко использовались во второй половине 20 века. В несколько хронологическом порядке: Иммуноэлектрофорезный анализ (одномерный иммуноэлектрофорез). ad modum Грабаря), перекрестный иммуноэлектрофорез (двумерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Кларк и Фриман или ad modum Лаурелл), ракетно-иммуноэлектрофорез (одномерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Laurell), иммуноэлектрофорез плавленых ракет ad modum Свендсен и Харбо, аффинный иммуноэлектрофорез ad modum Bøg-Hansen.

Метод

Агароза в виде пластинок 1% геля толщиной около 1 мм, забуференных при высокой pH (около 8,6) традиционно является предпочтительным для электрофореза, а также для реакции с антителами. Агароза была выбрана в качестве гелевой матрицы, поскольку она имеет большие поры, позволяющие свободное прохождение и разделение белков, но обеспечивает якорь для иммунопреципитатов белка и специфических антител. Был выбран высокий pH, потому что антитела практически неподвижны при высоком pH. Обычно для электрофореза рекомендуется оборудование для электрофореза с горизонтальной охлаждающей пластиной.

Иммунопреципитаты можно увидеть во влажном агарозном геле, но они окрашены белковыми пятнами, такими как Кумасси бриллиантовый синий в высохшем геле. В отличие от SDS-гель-электрофорез, электрофорез в агарозе позволяет создавать нативные условия, сохраняя нативную структуру и активность исследуемых белков, поэтому иммуноэлектрофорез позволяет охарактеризовать фермент активность и связывание лиганда и т. д. в дополнение к электрофоретическому разделению.

В иммуноэлектрофоретический анализ ad modum Грабарь классический метод иммуноэлектрофореза. Белки разделяют электрофорезом, затем антитела наносят в желоб рядом с отделенными белками, и после периода диффузии отделенных белков и антител друг против друга образуются иммунопреципитаты. Внедрение иммуноэлектрофорезного анализа дало большой импульс химии белков, одними из самых первых результатов было разделение белков в биологических жидкостях и биологических экстрактах. Среди важных наблюдений было большое количество различных белков в сыворотке крови, существование нескольких классов иммуноглобулинов и их электрофоретическая гетерогенность.

Плазмодий Глутаматдегидрогеназа (pGluDH), разделенная Противоиммуноэлектрофорез[1]

Скрещенный иммуноэлектрофорез также называется двумерным количественным иммуноэлектрофорезом. ad modum Кларк и Фриман или ad modum Лорелл. В этом методе белки сначала разделяются во время электрофореза в первом измерении, затем вместо диффузии к антителам протеины подвергаются электрофорезу в гель, содержащий антитела, во втором измерении. Иммунопреципитация будет происходить во время электрофореза второго измерения, и иммунопреципитаты имеют характерную форму колокола, каждый осадок представляет один антиген, причем положение осадка зависит от количества белка, а также количества специфических антител в геле, поэтому относительное может быть проведена количественная оценка. Чувствительность и разрешающая способность перекрестного иммуноэлектрофореза выше, чем у классического иммуноэлектрофореза, и существует множество вариантов этого метода, применимого для различных целей. Перекрестный иммуноэлектрофорез использовался для исследования белков в биологических жидкостях, особенно в сыворотке крови человека и биологических экстрактах.

Ракетный иммуноэлектрофорез - одномерный количественный иммуноэлектрофорез. Этот метод использовался для количественного определения белков сыворотки крови человека до того, как стали доступны автоматизированные методы.

Иммуноэлектрофорез плавленый ракетный представляет собой модификацию одномерного количественного иммуноэлектрофорса, используемого для детального измерения белков во фракциях из экспериментов по разделению белков.

Аффинный иммуноэлектрофорез основан на изменении электрофоретического рисунка белков посредством специфического взаимодействия или сложное образование с другим макромолекулы или лиганды. Аффинный иммуноэлектрофорез был использован для оценки константы привязки, как, например, с лектины или для характеристики белков с такими специфическими свойствами, как гликан содержание или лиганд привязка. Некоторые варианты аффинного иммуноэлектрофореза аналогичны аффинная хроматография с использованием иммобилизованных лиганды.

Открытая структура иммунопреципитата в агарозном геле позволит дополнительное связывание радиоактивно меченных антител для выявления специфических белков. Этот вариант использовался для идентификации аллергенов посредством реакции с IgE.

Два фактора определяют, что иммуноэлектрофорезные методы не получили широкого распространения. Во-первых, они довольно трудоемкие и требуют некоторого ручного опыта. Во-вторых, они требуют довольно большого количества поликлональных антител. Сегодня гель-электрофорез с последующим электроблоттинг является предпочтительным методом характеристики белков, поскольку он прост в использовании, имеет высокую чувствительность и низкую потребность в специфических антителах. Кроме того, белки разделены гель-электрофорез на основе их кажущейся молекулярной массы, что не достигается иммуноэлектрофорезом, но, тем не менее, иммуноэлектрофорезные методы все еще применимы, когда необходимы невосстанавливающие условия.

Рекомендации

  1. ^ Ling IT .; Cooksley S .; Bates PA .; Hempelmann E .; Wilson RJM. (1986). «Антитела к глутаматдегидрогеназе Plasmodium falciparum» (PDF). Паразитология. 92 (2): 313–324. Дои:10.1017 / S0031182000064088. PMID  3086819. S2CID  16953840.

внешняя ссылка