Пятно лейшмана - Leishman stain

Пятно Лейшмана, показывающее шизонтальную стадию Плазмодий вивакс малярийный паразит

Пятно лейшмана, также известный как Пятно лейшмана, используется в микроскопия за окрашивание мазки крови. Обычно он используется для различения и идентификации белые кровяные клетки, малярия паразиты и трипаносомы. Он основан на метанольный смесь «полихромных» метиленовый синий (т.е. деметилированный в различные лазурные) и эозин. Базовый раствор в метаноле стабилен и также служит для непосредственной фиксации мазка без предварительного этапа. Если рабочий раствор приготовить путем разбавления водным буфером, полученная смесь очень нестабильна и не может использоваться долго. Пятно Лейшмана названо в честь его изобретателя, Шотландский патолог Уильям Буг Лейшман. Это версия Романовский морилка, и, таким образом, аналогичен и частично заменяется на Пятно Гимзы, Пятно Дженнера, и Пятно Райта.

Подготовка и хранение

Многие компании продают Leishman Stain в виде сухого порошка, который позже восстанавливается с помощью метанол.^[1] Тепло и яркий свет окислять пятно и вызывают осаждение нерастворимых осадков, таких как метиленовый фиолетовый (Bernthsen) или соли эозината лазурь.^[2]

Преимущества и недостатки

Преимущества

В соответствии с Сэр Джон Вивиан Дэйси учебник Практическая гематология«Среди используемых в настоящее время красителей по Романовскому краситель Дженнера - самый простой, а краситель Гимзы - самый сложный. Окрашивание Лейшмана, занимающее промежуточное положение, до сих пор широко используется в рутинном окрашивании».

Протокол ВОЗ ^[3] упоминает:

Существует ряд различных комбинаций этих красителей, которые различаются по своим характеристикам окрашивания. Май-Грюнвальд-Гимза - хороший метод для рутинной работы. Окрашивание Райта - более простой метод, в то время как Окрашивание Лейшмана также является простым методом, который особенно подходит, когда срочно требуется получить окрашенный мазок крови или обычное окрашивание недоступно (например, ночью). Окрашивание Филда - это быстрое окрашивание, используемое в основном на тонких пленках для малярийных паразитов. Какой бы метод ни использовался, важно выбирать красители, не загрязненные другими красителями или солями металлов.

Сэр Уильям Буг Лейшман Лондона и Карл Рейтер Германии независимо обнаружил в 1901 году то, что считается «возможно, наиболее практичной модификацией пятен Малаховского»^[4] Они переняли лучшие черты красок, разработанных Малаховски и Дженнером, то есть использовали оба полихромированного метиленового синего (случайно сделанное Романовским, получившим такое название, систематическое нанесение Эрнст Малаховски еще до Романовского, и заново открыл Бернхард Нохт, но неизвестно Дженнеру, Мэй, Грюнвальду и многим другим, кто использовал простой метиленовый синий), и фильтрация осадка лазурного эозината из водной смеси и повторное растворение в спиртовом растворителе (мудрость Дженнера). Различия между методами Лейшмана и Рейтера заключались в следующем: Лейшман использовал метанол (как и Дженнер) и заменил эозин B на эозин Y, тогда как Рейтер использовал этиловый спирт и справедливо подчеркнул важность использования абсолютно чистого растворителя. Оба метода дали стойкое пятно желаемого пурпурного цвета.

Хороший контраст

Окраска Лейшмана обычно показывает ярко-фиолетовый цвет ядра и гранул нейтрофилов, для чего становится удобнее дифференциальный подсчет и качество окрашивания лучше, чем при окрашивании на основе простого метиленового синего и эозина, которые не создают достаточного контраста между цитоплазмой и ядро. Поскольку лейшман, как и другие красители по Романовскому, лучше окрашивает детали цитоплазмы и гранулы, гематологи обычно предпочитают их (однако о цитологах см. Ниже). По сравнению с дорогостоящими и токсичными чистыми синтетическими реагентами на основе AZure B и Eosin Y, используемыми эталонными методами ICSH, которые также не лишены недостатка, заключающегося в том, что они окисляются и в конечном итоге дают серый тон вместо оптимального синего цвета для цитоплазмы, Leishman является дешевым легкодоступная и простая в использовании техника, дающая довольно приемлемый контраст.

Хорошая чувствительность к малярийным паразитам

Было документально подтверждено, что окрашивание по Лейшману более чувствительно, чем окрашивание по Филду, и не хуже флуоресцентных красителей для выявления малярийных паразитов.^[5]

Недостатки

Сложность контроля молярного соотношения

Состав полихромированного метиленового синего, смешанного с эозином, никогда не бывает так хорош, как непосредственно взвешенные и смешанные пропорции в красителях типа Гимза. Альберт Плен в 1890 году^[6] выяснили, что молярное соотношение основных и кислотных красителей должно быть увеличено с 2: 1 до 3: 1, однако со времен Дженнерса (1899 г.) использование кристаллов лазурного эозината вернуло соотношение к неудовлетворительному 2: 1 и глубина цвета стала меньше. Это была только работа Густав Гимза и им подобных, которые снова вручную контролировали пропорцию этих двух компонентов, которая вернула глубину окрашивания. Однако Гимза и другие, кто искусственно контролировал пропорцию, иногда доходили до другой крайности (большой молярный избыток лазурного до соотношения 16,1), что, вероятно, было ненужным. на ICSH оптимальное соотношение составляет 6,5 к 7,3.^[7]

Нестабильность

Окраска Лейшмана при восстановлении буфером становится очень нестабильной (в отличие от красителей Гимза, которые относительно более стабильны благодаря глицерину, или эталонных красителей ICSH, которые используют метанол + ДМСО в соотношении 6: 4 об / об) и начинает осаждаться и требует повторной фильтрации. . При отсутствии тщательного контроля водопоглощение, испарение метанола из открытого контейнера и повторная фильтрация изменяют состав и требуют частой смены, что делает этот метод расточительным. Если не отфильтровать, осадок на мазке можно принять за тромбоциты. Важно не встряхивать флакон с красителем перед использованием, иначе осевший осадок будет ресуспендирован и осядет на пленке во время окрашивания и вызовет многочисленные артефакты и затруднит микроскопию.

Цитоплазматический контраст хороший, но ядерный контраст не так хорош, как H&E

Как и все другие методы Малаховского-Романовского-Гимзы, он со временем тускнеет и не может храниться в стабильном архиве надолго. Также его вышеупомянутые аналоги окрашивают ядра в темно-фиолетовый цвет, и детали ядерных функций не так ясны, как Гематоксилол и эозин, которые, таким образом, предпочитают некоторые цитопатологи. Но в этом случае это дополнительный метод (поскольку он окрашивает детали цитоплазмы, гранулы и т. Д. Лучше, чем H&E пятно ).