Массовое параллельное упорядочение сигнатур - Massively parallel signature sequencing

Массовое параллельное упорядочение подписей (MPSS) - это процедура, которая используется для идентификации и количественной оценки мРНК расшифровки, в результате чего данные похожи на серийный анализ экспрессии генов (SAGE), хотя в нем используется ряд биохимических и последовательность действий шаги, которые существенно отличаются.

Как это устроено

MPSS - это метод определения уровней экспрессии мРНК путем подсчета количества отдельных молекул мРНК, продуцируемых каждым геном. Это «открытый конец» в том смысле, что идентичность РНК, подлежащих измерению, не предопределена заранее, как это было с микрочипы экспрессии генов.

Образец мРНК сначала преобразуется в комплементарную ДНК (кДНК ) с помощью обратная транскриптаза, что упрощает последующие манипуляции. Эти кДНК присоединены к небольшому олигонуклеотид «тег», который позволяет кДНК быть ПЦР усиливается, а затем связывается с микрошариками. После нескольких раундов определения последовательности с использованием гибридизации флуоресцентно меченных зондов, сигнатура последовательности ~ 16-20 п.н. определяется для каждой гранулы. Флуоресцентная визуализация захватывает сигнал от всех шариков, будучи прикрепленной к двумерной поверхности, поэтому последовательности ДНК определяются для всех шариков параллельно. Происходит некоторая амплификация исходного материала, поэтому в итоге за эксперимент получают примерно 1 000 000 считываний последовательности.[1]

Обзор

MPSS позволяет мРНК транскрипты, которые должны быть идентифицированы посредством генерации 17-20 п.н. (базовая пара ) сигнатурная последовательность, смежная с 3'-концом самого 3'-сайта обозначенного рестрикционный фермент (обычно Sau3A или ДПНИИ ). Каждая последовательность подписи клонируется на один из миллиона микрошарики. Техника гарантирует, что только один тип ДНК последовательность находится на микрошарике. Таким образом, если в биологическом образце имеется 50 копий определенного транскрипта, эти транскрипты будут захвачены на 50 различных микрогранул, каждая из которых содержит примерно 100 000 амплифицированных копий определенной последовательности сигнатуры. Затем микрошарики собираются в проточная ячейка для секвенирования и количественной оценки. Сигнатуры последовательностей расшифровываются путем параллельной идентификации четырех оснований путем гибридизации с флуоресцентно меченными кодерами (рис. 5). Каждый из кодировщиков имеет уникальную метку, которая обнаруживается после гибридизации путем получения изображения массива микрогранул. Следующим шагом является расщепление и удаление этого набора из четырех оснований и выявление следующих четырех оснований для нового раунда гибридизации с кодировщиками и получением изображений. Исходный результат представляет собой список сигнатурных последовательностей 17–20 п.н., которые могут быть аннотированы в геном человека для идентификации гена.

Сравнение с SAGE

Более длинная последовательность тегов обеспечивает более высокую специфичность, чем классический тег SAGE 9–10 бп. Уровень экспрессии уникального гена представлен количеством транскриптов на миллион молекул, аналогично выходному сигналу SAGE. Существенным преимуществом является больший размер библиотеки по сравнению с SAGE. Библиотека MPSS обычно содержит 1 миллион тегов подписи, что примерно в 20 раз превышает размер библиотеки SAGE. Некоторые из недостатков, связанных с SAGE, применимы и к MPSS, например, потеря определенных транскриптов из-за отсутствия рестрикционный фермент узнаваемость сайта и неоднозначность в аннотации тегов. Высокая чувствительность и абсолютная экспрессия генов, безусловно, благоприятствуют MPSS. Однако эта технология доступна только через Lynxgen Therapeutics, Inc. (тогда Солекса Inc до 2006 года, а затем Иллюмина ).

Рекомендации

  1. ^ Schuler Group. «Массивно-параллельная последовательность подписей (MPSS)».

дальнейшее чтение

внешняя ссылка