Секвенирование Максама – Гилберта - Maxam–Gilbert sequencing

Секвенирование Максама – Гилберта это метод Секвенирование ДНК разработан Аллан Максам и Уолтер Гилберт в 1976–1977 гг. Этот метод основан на азотистое основание -специфическая частичная химическая модификация ДНК и последующая расщепление остова ДНК на сайтах, прилегающих к модифицированному нуклеотиды.[1]

Пример реакции Максама – Гилберта секвенирования. Расщепление одного и того же помеченного сегмента ДНК в разных точках дает меченые фрагменты разного размера. Затем фрагменты можно разделить с помощью гель-электрофореза.

Секвенирование Максама – Гилберта было первым широко применяемым методом секвенирования ДНК, и наряду с Метод дидезокси Сэнгера, представляет собой первое поколение методов секвенирования ДНК. Секвенирование Максама – Гилберта больше не широко используется, его заменили секвенирование следующего поколения методы.

История

Хотя Максам и Гилберт опубликовали свой метод химического секвенирования через два года после Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон опубликовали свою работу по секвенированию плюс-минус,[2][3] Секвенирование Максама – Гилберта быстро стало более популярным, так как очищенную ДНК можно было использовать напрямую, в то время как первоначальный метод Сэнгера требовал, чтобы каждое начало чтения было клонированный для производства одноцепочечной ДНК. Однако с улучшением метода обрыва цепи (см. Ниже) секвенирование Максама – Гилберта вышло из моды из-за своей технической сложности, запрещающей его использование в стандартных наборах молекулярной биологии, широкого использования опасных химических веществ и трудностей с масштабированием. вверх.[4]

Статья Аллана Максама и Уолтера Гилберта 1977 года «Новый метод секвенирования ДНК» была удостоена награды Citation for Chemical Breakthrough от отдела истории химии Американского химического общества за 2017 год. Она была представлена ​​Департаменту молекулярной и клеточной биологии. , Гарвардский университет.[5]

Процедура

Для секвенирования Максама – Гилберта требуется радиоактивная маркировка за один 5 ′ конец фрагмента ДНК, подлежащего секвенированию (обычно киназа реакция с использованием гамма-32п АТФ ) и очистка ДНК. Химическая обработка вызывает разрывы в небольшой пропорции одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A + G, C, C + T). Например, пурины (A + G) депуринируют, используя муравьиная кислота, то гуанины (и в некоторой степени аденины ) метилированы диметилсульфат, а пиримидины (C + T) гидролизуются с использованием гидразин. Добавление соли (хлорид натрия ) на реакцию с гидразином подавляет реакцию тимина на реакцию только с C. Затем модифицированные ДНК могут быть расщеплены горячим пиперидин; (CH2)5NH в позиции модифицированного основания. Концентрация модифицирующих химикатов контролируется для введения в среднем одной модификации на молекулу ДНК. Таким образом, образуется серия меченых фрагментов от конца с радиоактивной меткой до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле.

Фрагменты в четырех реакциях: электрофорез бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Для визуализации фрагментов гель экспонируют на рентгеновской пленке в течение авторадиография, что дает серию темных полос, каждая из которых показывает расположение идентичных радиоактивно меченных молекул ДНК. По наличию и отсутствию определенных фрагментов можно сделать вывод о последовательности.[1][6]

Связанные методы

Этот метод привел к анализу интерференции метилирования, который используется для картирования сайтов связывания ДНК для ДНК-связывающие белки.[7]

Автоматический протокол секвенирования Максама – Гилберта был разработан в 1994 году.[8]

Рекомендации

  1. ^ а б Максам А.М., Гилберт В. (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 74 (2): 560–4. Bibcode:1977ПНАС ... 74..560М. Дои:10.1073 / пнас.74.2.560. ЧВК  392330. PMID  265521.
  2. ^ Сэнгер Ф., Колсон А.Р. (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол. 94 (3): 441–8. Дои:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID  1100841.
  3. ^ Сангер Ф. Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК. Нобелевская лекция, 8 декабря 1980 г.
  4. ^ Грациано Песоле; Сесилия Сакконе (2003). Справочник по сравнительной геномике: принципы и методология. Нью-Йорк: Вили-Лисс. п. 133. ISBN  0-471-39128-X.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  5. ^ «Цитаты лауреатов премии Chemical Breakthrough Awards 2017». Отдел истории химии. Получено 12 марта 2018.
  6. ^ «Протоколы Колд-Спринг-Харбор - химическое секвенирование».
  7. ^ «Протоколы Колд-Спринг-Харбор - анализ интерференции метилирования».
  8. ^ Boland, EJ; Пиллаи, А; Одом, МВт; Джагадисваран, П. (июнь 1994 г.). «Автоматизация химического секвенирования реакций Максама-Гилберта». Биотехнологии. 16 (6): 1088–92, 1094–5. PMID  8074875.