Метаболическая инженерия - Metabolic engineering

Некоторые этапы разработки метаболического процесса

Метаболическая инженерия это практика оптимизации генетический и регуляторные процессы в клетки для увеличения выработки клетками определенного вещества. Эти процессы представляют собой химические сети, в которых используется серия биохимических реакций и ферменты которые позволяют клеткам преобразовывать сырье в молекулы, необходимые для выживания клетки. Метаболическая инженерия, в частности, стремится математически смоделировать эти сети, рассчитать выход полезных продуктов и точно определить части сети, которые ограничивают производство этих продуктов.[1] Генная инженерия Затем можно использовать методы для модификации сети, чтобы снять эти ограничения. И снова эта модифицированная сеть может быть смоделирована для расчета выхода нового продукта.

Конечная цель метаболической инженерии - иметь возможность использовать эти организмы для производства ценных веществ в промышленных масштабах рентабельным способом. Текущие примеры включают производство пиво, вино, сыр, фармацевтические препараты, и другие биотехнология продукты. Некоторые из общих стратегий, используемых для метаболической инженерии, включают (1) сверхэкспрессию гена, кодирующего ограничивающий скорость фермент пути биосинтеза, (2) блокирование конкурирующих метаболических путей, (3) экспрессию гетерологичных генов и (4) ферментную инженерию.[2]

Поскольку клетки используют эти метаболические сети для своего выживания, изменения могут сильно повлиять на жизнеспособность клеток. Следовательно, в метаболической инженерии возникает компромисс между способностью клеток производить желаемое вещество и их естественными потребностями в выживании. Следовательно, вместо прямого удаления и / или сверхэкспрессии генов, кодирующих метаболические ферменты, в настоящее время основное внимание уделяется нацеливанию на регуляторные сети в клетке, чтобы эффективно спроектировать метаболизм.[3]

История и приложения

Клеточный метаболизм можно оптимизировать для промышленного использования.

В прошлом, чтобы увеличить производительность желаемого метаболит, а микроорганизм был генетически модифицирован химически индуцированным мутация, и мутант напряжение затем был выбран сверхэкспрессирующий желаемый метаболит.[4] Однако одна из основных проблем этого метода заключалась в том, что метаболический путь производства этого метаболита не был проанализирован, и в результате были неизвестны ограничения на производство и соответствующие ферменты пути, которые должны были быть изменены.[4]

В 1990-х годах появилась новая техника, называемая метаболической инженерией. Этот метод анализирует метаболический путь микроорганизм, и определяет ограничения и их влияние на производство желаемых соединений. Затем он использует генную инженерию для снятия этих ограничений. Вот некоторые примеры успешной метаболической инженерии: (i) Выявление ограничений для производства лизина в Коринебактерии глутамикум и внедрение новых генов для снятия этих ограничений для улучшения производства[5] (ii) Разработка нового биосинтез жирных кислот путь, называемый обратным бета-окисление путь, который более эффективен, чем естественный путь производства жирных кислот и спиртов, которые потенциально могут быть каталитически преобразованы в химические вещества и топливо[6] (iii) Улучшение производства DAHP ароматический метаболит, производимый Кишечная палочка это промежуточный продукт при производстве ароматических аминокислот.[7] С помощью анализа метаболического потока было определено, что теоретический максимальный выход DAHP на используемую молекулу глюкозы составлял 3/7. Это связано с тем, что часть углерода из глюкозы теряется в виде диоксида углерода вместо того, чтобы использоваться для производства DAHP. Также один из метаболитов (PEP или фосфоенолпируват ), которые используются для производства DAHP, преобразовывались в пируват (PYR) для транспортировки глюкозы в клетку и, следовательно, больше не был доступен для производства DAHP. Чтобы уменьшить нехватку PEP и повысить урожайность, Patnaik et al. использовали генную инженерию на Кишечная палочка чтобы ввести реакцию, которая преобразует PYR обратно в PEP. Таким образом, PEP, используемый для транспортировки глюкозы в клетку, регенерируется и может использоваться для производства DAHP. Это привело к новому теоретическому максимальному выходу 6/7 - вдвое больше, чем у собственного урожая. Кишечная палочка система.

В промышленных масштабах метаболическая инженерия становится более удобной и рентабельной. Согласно Организация биотехнологической промышленности, "более 50 биоперерабатывающий завод объекты строятся по всей Северной Америке для применения метаболической инженерии для производства биотоплива и химикатов из возобновляемых источников. биомасса которые могут помочь сократить выбросы парниковых газов ". Возможные виды биотоплива включают короткоцепочечные спирты и алканы (для замены бензин ), метиловые эфиры жирных кислот и жирные спирты (заменить дизель ), и жирная кислота -и изопреноид биотопливо на основе (для замены дизель ).[8]

Метаболическая инженерия продолжает развиваться с точки зрения эффективности и процессов, чему способствуют прорывы в области синтетическая биология и прогресс в понимании повреждение метаболита и его восстановление или упреждение. Ранние эксперименты по метаболической инженерии показали, что накопление реактивные промежуточные продукты может ограничивать поток в сконструированных путях и быть вредным для клеток-хозяев, если соответствующие системы контроля повреждений отсутствуют или неадекватны.[9][10] Исследователи синтетической биологии оптимизируют генетические пути, которые, в свою очередь, влияют на метаболизм клеток. Недавнее снижение стоимости синтезированная ДНК и события в генетические схемы помочь повлиять на способность метаболической инженерии производить желаемые результаты.[11]

Анализ метаболического потока

Анализ метаболического потока можно найти на Анализ баланса потока

Настройка метаболического пути для анализа

Первым шагом в этом процессе является определение желаемой цели, которую необходимо достичь путем улучшения или модификации метаболизма организма. Справочники и онлайн-базы данных используются для исследования реакций и метаболических путей, которые могут привести к появлению этого продукта или результата. Эти базы данных содержат обширную геномную и химическую информацию, включая пути метаболизма и другие клеточные процессы. С помощью этого исследования выбирается организм, который будет использоваться для создания желаемого продукта или результата. При принятии этого решения учитываются следующие соображения: насколько близок метаболический путь организма к желаемому пути, затраты на обслуживание, связанные с организмом, и насколько легко изменить путь организма. кишечная палочка (Кишечная палочка) широко используется в метаболической инженерии для синтеза широкого спектра продуктов, таких как аминокислоты, поскольку его относительно легко поддерживать и модифицировать.[12] Если организм не содержит полного пути получения желаемого продукта или результата, тогда в организм должны быть включены гены, которые производят недостающие ферменты.

Анализ метаболического пути

Завершенный метаболический путь моделируется математически, чтобы определить теоретический выход продукта или потоки реакции в клетке. Поток - это скорость, с которой происходит данная реакция в сети. Простой анализ метаболических путей может быть выполнен вручную, но большинство из них требует использования программного обеспечения для выполнения вычислений.[13] Эти программы используют сложные алгоритмы линейной алгебры для решения этих моделей. Чтобы решить сеть с использованием уравнения для определенных систем, показанного ниже, необходимо ввести необходимую информацию о соответствующих реакциях и их потоках. Информация о реакции (такая как реагенты и стехиометрия) содержится в матрицах GИкс и Gм. Матрицы Vм и VИкс содержат потоки соответствующих реакций. После решения уравнение дает значения всех неизвестных потоков (содержащихся в VИкс).

Определение оптимальных генетических манипуляций

После определения потоков реакций в сети необходимо определить, какие реакции могут быть изменены, чтобы максимизировать выход желаемого продукта. Чтобы определить, какие именно генетические манипуляции выполнять, необходимо использовать вычислительные алгоритмы, такие как OptGene или OptFlux.[14] Они дают рекомендации относительно того, какие гены следует сверхэкспрессировать, нокаутировать или ввести в клетку, чтобы увеличить производство желаемого продукта. Например, если данная реакция имеет особенно низкий поток и ограничивает количество продукта, программное обеспечение может рекомендовать сверхэкспрессию фермента, катализирующего эту реакцию, в клетке для увеличения потока реакции. Необходимые генетические манипуляции могут быть выполнены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Гены могут быть сверхэкспрессированы или выбиты из организма, в зависимости от их влияния на путь и конечную цель.[15]

Экспериментальные измерения

Чтобы создать решаемую модель, часто необходимо иметь определенные потоки, уже известные или измеренные экспериментально. Кроме того, чтобы проверить влияние генетических манипуляций на метаболическую сеть (чтобы убедиться, что они совпадают с моделью), необходимо экспериментально измерить потоки в сети. Для измерения потоков реакции измерения потока углерода производятся с использованием Маркировка изотопов углерод-13.[16] Организм питается смесью, которая содержит молекулы, в которых атомы углерода сконструированы так, чтобы состоять из атомов углерода-13, а не углерода-12. После того, как эти молекулы используются в сети, последующие метаболиты также становятся меченными углеродом-13, поскольку они включают эти атомы в свои структуры. Специфический паттерн маркировки различных метаболитов определяется реакционными потоками в сети. Образцы маркировки могут быть измерены с использованием таких методов, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) вместе с вычислительными алгоритмами для определения потоков реакции.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Ян, Ю.Т., Беннет, Г.Н., Сан, К.Ю., (1998) Генетическая и метаболическая инженерия, Электронный журнал биотехнологии, ISSN  0717-3458
  2. ^ Кулкарни Р, 2016. Метаболическая инженерия: биологическое искусство производства полезных химических веществ. Резонанс, 21 (3), 233-237.
  3. ^ Вемури, Г.М., Аристиду, А.А., (2005) Метаболическая инженерия в эру -omics: выяснение и изменение регуляторных сетей, Обзор биологии микробных молей, том. 69: 197-216
  4. ^ а б Войт, Эберхард, Торрес, Нестор В. (2002) «Анализ и оптимизация путей в метаболической инженерии». Кембридж: University Press, p.ix-x
  5. ^ Стефанопулос, Г. Н., Аристиду, А. А., Нильсен, Дж. (1998). «Метаболическая инженерия: принципы и методологии». Сан-Диего: Academic Press
  6. ^ Делломонако, Клементина. (2011). Спроектированная реверсия цикла бета-окисления для синтеза топлива и химикатов. Природа 476,355-359
  7. ^ Патнаик Р. и Ляо Дж. (1994). «Разработка центрального метаболизма Escherichia coli для производства ароматических метаболитов с почти теоретическим выходом». Appl. Environ. Microbiol. 60(11):3903-3908
  8. ^ Кислинг Д., Джей (2010). Продвинутое производство биотоплива с помощью микробов. Biotechnol.J., 5,147-162
  9. ^ Мартин, Винсент Дж. Дж .; Pitera, Douglas J .; Холка, Сиднор Т .; Ньюман, Джек Д .; Кислинг, Джей Д. (01.07.2003). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природа Биотехнологии. 21 (7): 796–802. Дои:10.1038 / nbt833. ISSN  1087-0156. PMID  12778056.
  10. ^ Холка, Сиднор Т .; Gottlieb, Shayin S .; Лье, Бонни; Ньюман, Джек Д .; Кислинг, Джей Д. (2007-10-01). «Идентификация генов биосинтеза изопентенола из Bacillus subtilis с помощью метода скрининга, основанного на токсичности предшественников изопреноидов». Прикладная и экологическая микробиология. 73 (19): 6277–6283. Дои:10.1128 / AEM.00861-07. ISSN  0099-2240. ЧВК  2075014. PMID  17693564.
  11. ^ Стефанопулос, Грегори (2012-11-16). «Синтетическая биология и метаболическая инженерия». Синтетическая биология ACS. 1 (11): 514–525. Дои:10.1021 / sb300094q. PMID  23656228.
  12. ^ Калифорнийский университет - Лос-Анджелес (18 декабря 2008 г.). «Генетическая модификация превращает бактерии E. Coli в биотопливо высокой плотности». ScienceDaily. Получено 7 декабря 2011 г. из https://www.sciencedaily.com/releases/2008/12/081218151652.htm
  13. ^ Schellenberger, J., Que, R., Fleming, R., et al. (2011). «Количественное прогнозирование клеточного метаболизма с помощью моделей на основе ограничений: COBRA Toolbox v2.0». Протоколы природы. 6(9):1290-1307
  14. ^ Роча И., Майя П., Евангелиста П. и др. (2010). «OptFlux: программная платформа с открытым исходным кодом для метаболической инженерии in silico». BMC Sys Biol. 45 (4)
  15. ^ Уорк, Т.С., Хинтон, Р., Уорк, Э., Доброта, М., Чард, Т. (1980). «Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии». v.8
  16. ^ Wiechert, W. и de Graaf, A.A. (2000). «Шаги двунаправленной реакции в метаболических сетях: моделирование и моделирование экспериментов по маркировке изотопов углерода». Biotechnol. Bioeng. 55(1):101-117

внешние ссылки

Веб-сайт Организации биотехнологической промышленности (BIO):