Быстрая амплификация концов кДНК - Rapid amplification of cDNA ends

Быстрая амплификация концов кДНК (РАСА) - техника, используемая в молекулярная биология чтобы получить полную последовательность РНК расшифровка найдена в ячейке. RACE приводит к созданию кДНК копия интересующей последовательности РНК, полученная с помощью обратная транскрипция, с последующим ПЦР амплификация копий кДНК (см. ОТ-ПЦР ). Затем амплифицированные копии кДНК секвенируются и, если достаточно долго, должны картироваться в уникальной области генома. RACE обычно сопровождается клонированием перед секвенированием того, что изначально было отдельными молекулами РНК. Альтернативой с более высокой пропускной способностью, которая полезна для идентификации новых структур транскриптов, является секвенирование RACE-продуктов с помощью технологий секвенирования следующего поколения.

Процесс

RACE может предоставить последовательность транскрипта РНК от небольшой известной последовательности в транскрипте до 5 'конец (5 'RACE-PCR) или 3 'конец (3 'RACE-PCR) РНК. Этот прием иногда называют односторонняя ПЦР или же закрепленная ПЦР.

Первым шагом в RACE является использование обратной транскрипции для получения кДНК копия области транскрипта РНК. В этом процессе неизвестная конечная часть транскрипта копируется с использованием известной последовательности из центра транскрипции. Скопированная область ограничена известной последовательностью либо на 5 ', либо на 3' конце.

Протоколы для 5 'или 3' ГОНКИ немного отличаются. 5 'RACE-PCR начинается с использования мРНК в качестве матрицы для первого раунда синтеза кДНК (или обратная транскрипция ) реакция с использованием антисмысловой (обеспечить регресс) олигонуклеотид праймер, распознающий известную последовательность в середине интересующего гена; то грунтовка называется специфичный для гена праймер (GSP). Праймер связывается с мРНК, а ферментная обратная транскриптаза добавляет пары оснований к 3'-концу праймера для создания специфического одноцепочечного продукта кДНК; это обратный комплемент мРНК. После синтеза кДНК фермент терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) используется для добавления строки идентичных нуклеотиды, известный как гомополимерный хвост, на 3'-конце кДНК. (Есть и другие способы добавления 3'-концевой последовательности для первой цепи синтеза кДНК de novo, которые намного более эффективны, чем гомополимерные хвосты, но смысл метода остается тем же). ПЦР затем выполняется, который использует второй антисмысловой праймер, специфичный для гена (GSP2), который связывается с известной последовательностью, и смысловой (прямой) универсальный праймер (UP), который связывает гомополимерный хвост, добавленный к 3'-концам кДНК для амплификации продукта кДНК с 5'-конца.

3 'RACE-PCR использует естественный полиА хвост который существует на 3'-конце всех мРНК эукариот для прайминга во время обратной транскрипции, поэтому этот метод не требует добавления нуклеотидов с помощью TdT. кДНК генерируются с использованием Олиго-dT -адапторный праймер (праймер с короткой последовательностью дезокситиминовых нуклеотидов), дополняющий полиА stretch и добавляет специальную последовательность адаптера к 5'-концу каждой кДНК. Затем используется ПЦР для амплификации 3'-кДНК из известной области с использованием смыслового GSP и антисмыслового праймера, комплементарного адапторной последовательности.

RACE-секвенирование

В кДНК молекулы, генерируемые RACE, можно секвенировать, используя высокопроизводительное секвенирование технологии (также называемые RACE-seq). Определение характеристик фрагментов RACE с помощью высокопроизводительного секвенирования очень эффективно по времени, более чувствительно, менее затратно и технически осуществимо по сравнению с традиционной характеристикой фрагментов RACE с помощью молекулярное клонирование с последующим Секвенирование по Сэнгеру из нескольких клонов.

История и приложения

RACE можно использовать для амплификации неизвестных 5 '(5'-RACE) или 3' (3'-RACE) частей молекул РНК, где часть последовательности РНК известна и нацелена на специфичный для гена праймер. В сочетании с высокопроизводительным секвенированием для характеристики этих амплифицированных продуктов RACE можно применить этот подход для характеристики любых типов кодирующих или некодирующих молекул РНК.

Идея сочетания RACE с высокопроизводительным секвенированием была впервые представлена ​​в 2009 году как Deep-RACE для выполнения сопоставления Сайты начала транскрипции (TSS) 17 генов в одной клеточной линии.[1] Например, в исследовании 2014 года по точному картированию сайтов расщепления целевой РНК, направляемой синтетическим миРНК, этот подход был впервые назван RACE-seq.[2] Кроме того, методология использовалась для характеристики неизвестных частей полноразмерных новых транскриптов и стенограммы слияния в колоректальный рак.[3] В другом исследовании, целью которого было охарактеризовать неизвестные структуры транскриптов днРНК, RACE использовался в сочетании с полудлинным 454 секвенирование.[4]

Рекомендации

  1. ^ Olivarius, S; Плесси, К; Карнинчи, П. (февраль 2009 г.). «Высокопроизводительная проверка сайтов начала транскрипции с помощью Deep-RACE» (PDF). Биотехнологии. 46 (2): 130–2. Дои:10.2144/000113066. PMID  19317658.
  2. ^ Дениз, H; Moschos, SA; Сиддерс, Б. Бремя, F; Perkins, H; Картер, N; Страуд, Т; Кеннеди, М. Fancy, SA; Лапторн, C; Лаванда, H; Kinloch, R; Сухи, D; Корбау, Р. (4 февраля 2014 г.). «Понимание глубинного секвенирования терапевтической обработки shRNA и точности расщепления мишени siRNA». Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты. 3: e145. Дои:10.1038 / mtna.2013.73. ЧВК  3951910. PMID  24496437.
  3. ^ Хофф, AM; Йоханнесен, B; Алагаратнам, S; Чжао, S; Ном, Т; Løvf, M; Баккен, AC; Hektoen, M; Свин, А; Lothe, RA; Скотейм, Р.И. (3 ноября 2015 г.). «Новые варианты РНК при колоректальном раке». Oncotarget. 6 (34): 36587–602. Дои:10.18632 / oncotarget.5500. ЧВК  4742197. PMID  26474385.
  4. ^ Лагард, Жюльен; Ущинска-Ратайчак, Барбара; Сантойо-Лопес, Хавьер; Гонсалес, Хосе Мануэль; Тапанари, Электра; Мадж, Джонатан М .; Стюард, Чарльз А .; Уилминг, Лоренс; Танзер, Андреа; Ховальд, Седрик; Краст, Жаклин; Вела-Боза, Алисия; Руэда, Антонио; Лопес-Доминго, Франсиско Дж .; Допазо, Хоакин; Реймонд, Александр; Гиго, Родерик; Харроу, Дженнифер (17 августа 2016 г.). «Расширение транскриптов днРНК человека с помощью RACE в сочетании с долгосрочным высокопроизводительным секвенированием (RACE-Seq)». Nature Communications. 7: 12339. Bibcode:2016НатКо ... 712339L. Дои:10.1038 / ncomms12339. ЧВК  4992054. PMID  27531712.
  • «Быстрая амплификация концов 5'-кДНК», в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ред. Sambrook, J. & Russell, DW), Глава 8 Протокол 9, 8.54-8,60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York , США, 2001 г.)
  • Принципы генной манипуляции и геномики, С. Б. Примроуз и Р. М. Твайман, Blackwell Publishing, 2006 г. (7-е изд.), Страницы 111-12.

внешняя ссылка