Бисульфитное секвенирование с пониженным представлением - Reduced representation bisulfite sequencing

Бисульфитное секвенирование с пониженным представлением (RRBS) - эффективный и высокопроизводительный метод анализа геномного метилирование профили на однонуклеотидном уровне. Он сочетает в себе рестрикционные ферменты и бисульфитное секвенирование для обогащения участков генома с высоким CpG содержание. Из-за высокой стоимости и глубины последовательность действий для анализа статуса метилирования во всем геноме Meissner et al. разработал этот метод в 2005 году, чтобы уменьшить количество нуклеотидов, необходимых для секвенирования, до 1% генома.^[1] Фрагменты, которые составляют сокращенный геном, все еще включают большинство промоутеры, а также такие регионы, как повторяющиеся последовательности которые трудно профилировать с помощью обычных подходов к бисульфитному секвенированию.^[2]

Схема протокола для секвенирования бисульфита с уменьшенным представлением

Обзор протокола

1. Ферментное переваривание: сначала геномная ДНК переваривается с помощью рестрикционного фермента, нечувствительного к метилированию. Неотъемлемой частью ферментов является то, что на них не влияет статус метилирования CpG (сайтов в геноме, где цитозин находится рядом с гуанин ), поскольку это позволяет переваривать как метилированные, так и неметилированные области. MspI обычно используется. Этот фермент нацелен на последовательности 5’CCGG3 ’и расщепляет фосфодиэфирные связи перед динуклеотидом CpG. При использовании этого конкретного фермента каждый фрагмент имеет CpG на каждом конце. Это переваривание приводит к образованию фрагментов ДНК различного размера.
2. Конечная репарация и A-хвосты: из-за характера того, как MspI расщепляет двухцепочечную ДНК, эта реакция приводит к образованию цепей с липкие концы. Конечный ремонт необходим для заполнения 3-дюймового концевого участка жил. Следующим шагом будет добавление дополнительного аденозина к обоим плюс и минус пряди. Это называется A-Tailing и необходимо для лигирования адаптера на следующем этапе. Концевое восстановление и A-хвост осуществляется в рамках одних и тех же реакций с дезоксирибонуклеотидами dCTP, dGTP и dATP. Чтобы повысить эффективность хвоста А, в эту реакцию добавляют дАТФ в избытке.
3. Адаптеры последовательности: адаптеры метилированной последовательности лигируют с фрагментами ДНК. Метилированный адаптер олигонуклеотиды заменить все цитозины на 5’-метилцитозины, чтобы предотвратить дезаминирование этих цитозинов в реакции превращения бисульфита. Для секвенирования реакций с использованием секвенсоров Illumina адаптеры последовательностей гибридизируются с адаптерами на проточной ячейке.
4. Очистка фрагментов: для очистки выбирается желаемый размер фрагментов. Фрагменты разного размера разделяются с помощью гель-электрофорез и очищаются с помощью вырезания из геля. Согласно Gu et al., Фрагменты ДНК из 40-220 пар оснований являются репрезентативными для большинства промоторных последовательностей и Острова CpG^[2]
5. Преобразование бисульфита: фрагменты ДНК затем превращаются в бисульфит, что представляет собой процесс, который дезаминирует неметилированный цитозин в урацил. Метилированные цитозины остаются неизменными из-за метильной группы, защищающей их от реакции.
6. ПЦР-амплификация: ДНК, преобразованная бисульфитом, затем амплифицируется с использованием ПЦР с грунтовки которые дополняют адаптеры последовательности.
7. Очистка ПЦР. Перед секвенированием продукт ПЦР не должен содержать неиспользованных реакционных реагентов, таких как не включенные дНТФ или соли. Таким образом, требуется этап очистки ПЦР. Это можно сделать, используя другой гель для электрофореза или используя наборы, разработанные специально для очистки ПЦР.
8. Секвенирование: затем фрагменты секвенируются. Когда RRBS был впервые разработан, Секвенирование по Сэнгеру изначально использовался. Теперь используются подходы к секвенированию следующего поколения. Для секвенирования Illumina чаще всего выполняются односторонние чтения по 36 оснований.
9. Выравнивание и анализ последовательностей: из-за уникальных свойств RRBS для выравнивания и анализа требуется специальное программное обеспечение.^[3] Использование MspI для переваривания геномной ДНК приводит к получению фрагментов, которые всегда начинаются с буквы C (если цитозин метилирован) или T (если цитозин не был метилирован и был преобразован в урацил в реакции превращения бисульфита). Это приводит к неслучайной композиции пар оснований. Кроме того, базовый состав искажен из-за смещенных частот C и T в образцах. Доступно различное программное обеспечение для выравнивания и анализа, такое как Maq, BS Seeker, Bismark или BSMAP. Выравнивание по эталонному геному позволяет программам идентифицировать метилированные пары оснований в геноме.

Протокол секвенирования бисульфита с пониженным представлением

Преимущества

Обогащение CpG

RRBS уникальным образом использует специфический рестрикционный фермент для обогащения CpG. Расщепление MspI или любой рестрикционный фермент, который распознает CpG и разрезает их, производит только фрагменты с CG на конце.^[2] Этот подход обогащает CpG-участки генома, поэтому он может уменьшить объем необходимого секвенирования, а также снизить стоимость.^[2] Этот метод экономически эффективен, особенно при фокусировании на распространенных областях CpG.

Низкий ввод образца

Для точного анализа данных требуется только низкая концентрация образца, от 10 до 300 нг.^[2] Этот метод можно использовать при недостатке ценных образцов. Еще один положительный момент - не требуются свежие или живые образцы. Также можно использовать вводы, фиксированные формалином и залитые парафином.^[2]

Ограничения

Фермент рестрикции

В конкретных этапах протокола также есть некоторые ограничения. Переваривание MspI охватывает большинство, но не все области CG в геноме.^[2] Некоторые CpG упущены. Отсутствие CpG также может произойти, поскольку этот протокол представляет собой только репрезентативную выборку генома.^[2] Таким образом, в некоторых регионах охват ниже. В других вариантах этого протокола используются альтернативные ферменты.^[4]

ПЦР

Во время части протокола ПЦР необходимо использовать непроверяющую полимеразу, поскольку фермент корректирующего считывания остановится на остатках урацила, обнаруженных в матрице оцДНК.^[1] Использование полимеразы, не подлежащей проверке, также может привести к увеличению ошибок секвенирования ПЦР.^[1]

Бисульфитное секвенирование

Бисульфитное секвенирование преобразует только одноцепочечную ДНК (оцДНК). Полное превращение бисульфита требует тщательной денатурации и отсутствия повторного отжига двухцепочечной ДНК (дцДНК).^[1] Было показано, что простые шаги протокола приводят к полной денатурации. Обеспечение использования мелких фрагментов путем разрезания или расщепления, свежих реагентов и достаточного времени денатурации имеет решающее значение для полной денатурации. ^[5] Другой предложенный метод - проведение бисульфитной реакции при 95 ° C, хотя деградация ДНК также происходит при высоких температурах.^[5] Прогнозируется, что в первый час реакции бисульфита менее 90% ДНК образца будет потеряно для разложения. ^[6] Баланс между высокой и низкой температурой необходим для обеспечения полной денатурации и снижения деградации ДНК. Также можно использовать реагенты, такие как мочевина, которые предотвращают образование дцДНК.^[5] При загрязнении дцДНК может быть трудно точно вычислить данные.^[1] Когда наблюдается непревращенный цитозин, трудно отличить отсутствие метилирования от артефакта.^[1]

Значимость

Значение этого метода заключается в том, что он позволяет секвенировать метилированные области, которые нельзя должным образом профилировать с помощью обычных методов бисульфитного секвенирования. Современные технологии секвенирования ограничены в отношении областей профилирования повторяющихся последовательностей.^[7] Это вызывает сожаление в отношении исследований метилирования, поскольку эти повторяющиеся последовательности часто содержат метилированные цитозины. Это особенно ограничивает исследования, связанные с профилированием. рак геномов, поскольку потеря метилирования в этих повторяющихся последовательностях наблюдается при многих типах рака.^[8] RRBS устраняет проблемы, возникающие из-за этих больших областей повторяющихся последовательностей, и, таким образом, позволяет более полно аннотировать эти области.

Приложения

Метиломы в геномике рака

Аберрантное метилирование наблюдается при раке.^[9] При раке в опухолях наблюдается гиперметилирование, а также гипометилирование.^[9] Поскольку RRBS очень чувствителен, этот метод можно использовать для быстрого изучения аберрантного метилирования при раке.^[10] Если можно получить образцы опухолевых и нормальных клеток пациента, можно будет наблюдать сравнение между этими двумя типами клеток.^[2][10] Профиль общего метилирования может быть получен довольно быстро.^[2] Этот метод позволяет быстро определить общий статус метилирования геномов рака, что является экономически эффективным с точки зрения затрат и времени.

Состояния метилирования в развитии

Специфические для стадии изменения наблюдаются у всех живых организмов. Модификации общих уровней метилирования посредством секвенирования бисульфитов с пониженной репрезентативностью могут быть полезны в биологии развития.

Сравнение с другими техниками

Результаты, сравниваемые между RRBS и MethylC-seq, хорошо согласуются друг с другом.^[11] Естественно, MethylC-seq имеет больший охват CpG по всему геному по сравнению с RRBS, но RRBS имеет большее покрытие на островках CpG.^[11]Одним из других наиболее часто используемых методов профилирования метилирования является MeDiP-Seq. Этот метод осуществляется путем иммунопреципитации метилированных цитозинов и последующего секвенирования.^[11] RRBS имеет более высокое разрешение по сравнению с этим методом, поскольку MeDip-Seq ограничен 150 парами оснований по сравнению с разрешением в один нуклеотид RRBS.^[11] Бисульфитные методы, такие как используемые RRBS, также оказались более точными, чем методы на основе обогащения, такие как MeDip-Seq.^[7] Данные, полученные по RRBS и метилированию Illumina Infinium, очень сопоставимы с корреляцией Пирсона 0,92.^[7] Данные для обеих платформ также напрямую сопоставимы, поскольку обе используют абсолютное измерение ДНК.

Рекомендации

1. Александр Мейснер, Андреас Гнирке, Джордж У. Белл, Бернар Рамсахой, Эрик С. Ландер и Рудольф Яниш. 2005. «Сокращенное представление бисульфитного секвенирования для сравнительного анализа метилирования ДНК с высоким разрешением». Нуклеиновые кислоты Res. 33(18):5868-77
2. Гу Х, Смит З. Д., Бок С., Бойл П., Гнирке А., Мейснер А. 2011. «Подготовка библиотек секвенирования бисульфита с уменьшенным представлением для профилирования метилирования ДНК в масштабе генома». Нат Проток. 6(4):468-81. Дои:10.1038 / нпрот.2010.190.
3. Чаттерджи A, Роджер EJ, Стоквелл PA, Weeks RJ, Morison IM. 2012. «Технические аспекты секвенирования бисульфита с уменьшенным представлением с мультиплексированными библиотеками». J Biomed Biotechnol. 2012:741542. Дои:10.1155/2012/741542
4. Трукки, Эмилиано; Маццарелла, Анна Б.; Gilfillan, Gregor D .; Лоренцо, Мария Т .; Шенсветтер, Питер; Паун, Овидиу (апрель 2016 г.). «BsRADseq: скрининг метилирования ДНК в естественных популяциях немодельных видов». Молекулярная экология. 25 (8): 1697–1713. Дои:10.1111 / mec.13550. ЧВК  4949719. PMID  26818626.
5. Варнерке, П. Стирзакер, К., Сонг, Дж., Грунау, К., Мелки, Дж. Р., Кларк, С.Дж. 2002. «Идентификация и разрешение артефактов в бисульфитном секвенировании». Методы. 27: 101-107.
6. Грунау, С., Кларк, С.Дж. и Розенталь А. 2001. "Бисульфитное геномное секвенирование: систематическое исследование критических экспериментальных параметров". Нуклеиновые кислоты Res., 29, E65–65.
7. Бок С., Томазу Е.М., Бринкман А.Б., Мюллер Ф., Симмер Ф., Гу Х., Джегер Н., Гнирке А., Штунненберг Х.Г., Мейснер А. 2010. «Количественное сравнение технологий картирования метилирования ДНК по всему геному». Nat Biotechnol. 28(10):1106-14. Дои:10.1038 / nbt.1681
8. Эрлих М. 2009. «Гипометилирование ДНК в раковых клетках». Эпигеномика. 1(2):239-59. Дои:10.2217 / epi.09.33.
9. Veersteeg, R. 1997. Аберрантное метилирование при раке. Американский журнал генетики человека. 60:751-754.
10. Смит, З.Д., Гу, Х., Бок, С., Гнике, А., и Мейснер, А. 2009. Секвенирование бисульфита с высокой пропускной способностью в геномах млекопитающих. Методы. 48: 226-232.
11. Харрис, Алан и др. 2010. «Сравнение методов на основе секвенирования для профилирования метилирования ДНК и идентификации моноаллельных эпигенетических модификаций» Природа Биотехнологии 28:1097-1105.