Бисульфитное секвенирование - Bisulfite sequencing

Рисунок 1: Схема бисульфитной конверсии образца последовательности геномной ДНК. Нуклеотиды синего цвета - это неметилированные цитозины, превращенные в урацилы бисульфитом, а красные нуклеотиды - это 5-метилцитозины, устойчивые к превращению.
Рисунок 2: Схема химической реакции, лежащей в основе катализируемого бисульфитом превращения цитозина в урацил.

Бисульфит[1] последовательность действий (также известный как бисульфитное секвенирование) - это использование бисульфит лечение ДНК перед рутиной последовательность действий определить образец метилирование. Метилирование ДНК был первым обнаружен эпигенетический марки, и остается наиболее изученной. У животных это преимущественно связано с добавлением метильная группа в позицию углерода-5 цитозин остатки динуклеотида CpG, и причастен к подавлению транскрипционная активность.

Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил, но уходит 5-метилцитозин остатки не затронуты. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Таким образом, обработка бисульфитом вносит специфические изменения в Последовательность ДНК которые зависят от статуса метилирования отдельных остатков цитозина, что дает однонуклеотидную разрешающую информацию о статусе метилирования сегмента ДНК. Для получения этой информации можно выполнить различные анализы измененной последовательности. Таким образом, цель этого анализа сводится к различению между однонуклеотидный полиморфизм (цитозины и тимидин ) в результате преобразования бисульфита (Рисунок 1).

Методы

При бисульфитном секвенировании используются стандартные методы секвенирования геномной ДНК, обработанной бисульфитом, для определения статуса метилирования динуклеотидов CpG. Другие стратегии, не связанные с секвенированием, также используются для исследования метилирования в определенных локусах или в геном -широкий уровень. Все стратегии предполагают, что индуцированное бисульфитом превращение неметилированных цитозинов в урацил завершено, и это служит основой для всех последующих методик. В идеале используемый метод должен определять статус метилирования отдельно для каждого аллель. Альтернативные методы бисульфитного секвенирования включают: Комбинированный анализ ограничения бисульфита и иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP).

Методики анализа ДНК, обработанной бисульфитом, постоянно разрабатываются. Чтобы обобщить эти быстро развивающиеся методологии, было написано множество обзорных статей.[2][3][4][5]

Методологии в целом можно разделить на стратегии, основанные на ПЦР, специфичном для метилирования (MSP) (рисунок 4), и стратегии, использующие полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводится в условиях, не связанных с метилированием (рис. 3). В методах на основе микрочипов также используется ПЦР, основанная на неметилировании.

Методы на основе неметилирования ПЦР

Рисунок 3: Методы анализа метилирования ДНК, не основанные на ПЦР, специфичной для метилирования. После превращения бисульфита геномная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР, которая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Затем используются многочисленные доступные методы для определения различий на основе изменений внутри ампликона в результате преобразования бисульфита.

Прямое секвенирование

Первый опубликованный метод анализа метилирования с использованием бисульфитно-обработанной ДНК с использованием ПЦР и стандартного дидезоксинуклеотида. Секвенирование ДНК для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к превращению бисульфита.[6] Праймеры сконструированы так, чтобы быть специфичными для цепи, а также специфичными для бисульфита (т.е. праймеры, содержащие цитозины, не относящиеся к CpG, так что они не комплементарны ДНК, не обработанной бисульфитом), фланкируя (но не вовлекая) интересующий сайт метилирования. Следовательно, он будет амплифицировать как метилированные, так и неметилированные последовательности, в отличие от специфичной для метилирования ПЦР. Все сайты неметилированных цитозинов отображаются как тимин в полученной амплифицированной последовательности смысловой цепи, и как аденины в усиленном антисмысловой прядь. Путем включения адаптеров высокопроизводительного секвенирования в праймеры для ПЦР продукты ПЦР можно секвенировать с помощью массового параллельного секвенирования. Альтернативно и трудоемко, продукт ПЦР можно клонировать и секвенировать. Вложенная ПЦР методы могут быть использованы для улучшения продукта для последовательность действий.

Все последующие методы анализа метилирования ДНК с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, основаны на этом отчете Frommer et al. (Фигура 2).[6] Хотя большинство других методов не являются методами, основанными на истинном секвенировании, термин «бисульфитное секвенирование» часто используется для описания методов анализа метилирования ДНК с превращением бисульфита в целом.

Пиросеквенирование

Пиросеквенирование также использовался для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, без использования ПЦР, специфичной для метилирования.[7][8] После ПЦР-амплификации интересующей области пиросеквенирование используется для определения бисульфит-превращенной последовательности специфических CpG сайты в регионе. Отношение C-к-T в отдельных сайтах можно определить количественно на основании количества включенных C и T во время удлинения последовательности. Основное ограничение этого метода - стоимость технологии. Тем не менее, пиросеквенирование позволяет расширить высокопроизводительный скрининг методы.

Дальнейшее усовершенствование этого метода было недавно описано Wong et al., В котором используются аллель-специфические праймеры, включающие однонуклеотидные полиморфизмы в последовательность праймера для секвенирования, что позволяет проводить раздельный анализ материнского и отцовского аллели.[9] Этот метод особенно полезен для геномный импринтинг анализ.

Чувствительный к метилированию однонитевой конформационный анализ (MS-SSCA)

Этот метод основан на однонитевой конформационный полиморфизм анализ (SSCA), разработанный для однонуклеотидный полиморфизм (SNP) анализ.[10] SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК одинакового размера, но с различной последовательностью на основе дифференциальной миграции в неденатурирующих условиях. электрофорез. В MS-SSCA это используется для различения обработанных бисульфитом, амплифицированных с помощью ПЦР участков, содержащих интересующие сайты CpG. Хотя SSCA не хватает чувствительности, когда только один нуклеотид разница присутствует, обработка бисульфитом часто приводит к ряду преобразований C-to-T в большинстве областей интереса, и результирующая чувствительность приближается к 100%. MS-SSCA также обеспечивает полуколичественный анализ степени метилирования ДНК на основе соотношения интенсивностей полос. Однако этот метод предназначен для оценки всех CpG сайты целиком в интересующей области, а не в отдельных сайтах метилирования.

Анализ плавления с высоким разрешением (HRM)

Еще один метод дифференциации преобразованной ДНК от непревращенной обработанной бисульфитом ДНК - это использование анализа плавления с высоким разрешением (HRM), a количественная ПЦР методика, изначально разработанная для различения SNP.[11] ПЦР ампликоны анализируются непосредственно по линейному изменению температуры и в результате высвобождения интеркалирующего флуоресцентный краситель во время плавления. Степень метилирования, представленная содержанием C-to-T в ампликон, определяет скорость плавления и последующего высвобождения красителя. Этот метод позволяет проводить прямой количественный анализ в одной пробирке, но оценивает метилирование в амплифицированной области в целом, а не на отдельных участках. CpG сайты.

Удлинение однонуклеотидного праймера, чувствительного к метилированию (MS-SnuPE)

MS-SnuPE использует метод удлинения праймера, изначально разработанный для анализа однонуклеотидные полиморфизмы.[12] ДНК превращается в бисульфит, и специфичные для бисульфита праймеры отжигаются с последовательностью до пары оснований непосредственно перед представляющим интерес CpG. Праймер может расширить одну пару оснований в C (или T), используя ДНК-полимераза прекращение дидезоксинуклеотиды, а отношение C к T определяется количественно.

Для определения этого отношения C: T можно использовать ряд методов. Вначале MS-SnuPE полагалась на радиоактивные ddNTPs в качестве репортера удлинения праймера. Методы на основе флуоресценции или Пиросеквенирование также можно использовать.[13] Однако матричная лазерная десорбционная ионизация / время пролета (МАЛДИ-ТОФ ) масс-спектрометрии Анализ для различения двух продуктов удлинения полиморфных праймеров может быть использован, по существу, на основе анализа GOOD, разработанного для SNP-генотипирование. Ионная пара с обратной фазой высокоэффективная жидкостная хроматография (IP-RP-ВЭЖХ ) также использовался для различения продуктов удлинения праймеров.[14]

Основно-специфическое расщепление / MALDI-TOF

Недавно описанный метод Ehrich et al. дополнительно использует преимущества бисульфитных превращений путем добавления стадии расщепления, специфичной для оснований, для усиления информации, полученной в результате нуклеотидных изменений.[15] При первом использовании in vitro транскрипция интересующего региона в РНК (добавив РНК-полимераза промоутер сайт к праймеру ПЦР в начальной амплификации), РНКаза А может использоваться для расщепления РНК стенограмма на базовых сайтах. В качестве РНКаза А раскалывает РНК особенно на цитозин и урацил рибонуклеотиды, специфичность к основанию достигается путем добавления устойчивых к расщеплению dTTP когда желательно цитозин-специфическое (C-специфическое) расщепление, и включение dCTP, когда желательно урацил-специфическое (U-специфическое) расщепление. Затем расщепленные фрагменты можно проанализировать с помощью МАЛДИ-ТОФ. Обработка бисульфитом приводит либо к введению / удалению сайтов расщепления посредством преобразований C-to-U, либо к сдвигу массы фрагмента за счет преобразований G-в-A в амплифицированной обратной цепи. C-специфическое расщепление будет специфично разрезать все метилированные CpG сайты. Анализируя размеры полученных фрагментов, можно определить конкретный паттерн метилирования ДНК CpG сайты внутри региона, а не для определения степени метилирования региона в целом. Этот метод продемонстрировал эффективность для высокопроизводительный скрининг, позволяющий опросить множество CpG сайты в нескольких тканях экономичным способом.

ПЦР, специфичная для метилирования (MSP)

Рисунок 4: ПЦР, специфичная для метилирования, представляет собой чувствительный метод для дискриминационной амплификации и обнаружения интересующей метилированной области с использованием специфичных для метилирования праймеров на геномной ДНК, преобразованной бисульфитом. Такие праймеры будут отжигаться только с последовательностями, которые метилированы и, таким образом, содержат 5-метилцитозины устойчивые к превращению бисульфитом. Альтернативно можно использовать неметилированные специфические праймеры.

Этот альтернативный метод анализа метилирования также использует ДНК, обработанную бисульфитом, но позволяет избежать необходимости секвенировать интересующую область.[16] Вместо этого пары праймеров конструируются так, чтобы быть «метилированно-специфическими», включая последовательности, дополняющие только непревращенные 5-метилцитозины, или, наоборот, «неметилированный специфический», дополняющий тимин превращается из неметилированных цитозинов. Метилирование определяется способностью конкретного праймера достигать амплификации. Этот метод особенно полезен для допроса Острова CpG с возможно высокой плотностью метилирования, так как повышенное количество пар CpG в праймере увеличивает специфичность анализа. Размещение пары CpG на 3'-конце праймера также улучшает чувствительность. Первоначальный отчет с использованием MSP описал достаточную чувствительность для обнаружения метилирования 0,1% аллели. В целом, MSP и связанные с ним протоколы считаются наиболее чувствительными при запросе статуса метилирования в конкретном месте. локус.

Метод MethyLight основан на MSP, но обеспечивает количественный анализ с использованием количественная ПЦР.[17] Используются метилированные специфические праймеры, а также метилированный репортерный зонд флуоресценции, который отжигается с амплифицированной областью. Альтернативно, праймеры или зонд могут быть сконструированы без специфичности метилирования, если необходимо различение пар CpG в задействованных последовательностях. Количественное определение проводится для метилированной эталонной ДНК. Модификация этого протокола для увеличения специфичности ПЦР для успешно преобразованной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) использует дополнительный зонд для бисульфит-неконвертированной ДНК для количественной оценки этой неспецифической амплификации.[18]

Дальнейшая методология с использованием MSP-амплифицированной ДНК анализирует продукты с использованием анализ кривой плавления (Мак-МСП).[19] Этот метод амплифицирует ДНК, преобразованную бисульфитом, с праймерами, специфичными как для метилированного, так и для неметилированного компонентов, и определяет количественное соотношение двух продуктов путем сравнения дифференциальных пиков, полученных при анализе кривой плавления. Метод анализа плавления с высоким разрешением, который использует оба количественная ПЦР и был введен анализ плавления, в частности, для чувствительного обнаружения метилирования низкого уровня[20]

Методы на основе микрочипов

Микрочип Методы, основанные на методах, являются логическим продолжением технологий, доступных для анализа обработанной бисульфитом ДНК, что позволяет проводить анализ метилирования в масштабе всего генома.[21] Олигонуклеотидные микрочипы разработаны с использованием пар олигонуклеотид зонды гибридизации нацеливание CpG сайты представляет интерес. Один комплементарен неизмененной метилированной последовательности, а другой комплементарен неметилированной последовательности, преобразованной из C в U. Зонды также являются бисульфит-специфичными для предотвращения связывания с ДНК, не полностью преобразованной бисульфитом. В Анализ метилирования Illumina является одним из таких анализов, в котором технология бисульфитного секвенирования применяется на уровне микрочипов для получения данных о метилировании всего генома.

Ограничения

5-гидроксиметилцитозин

Бисульфитное секвенирование широко используется в геномах млекопитающих, однако сложности возникли с открытием новой модификации ДНК млекопитающих. 5-гидроксиметилцитозин.[22][23] 5-Гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат при обработке бисульфитом, который затем читается как C при секвенировании.[24] Таким образом, бисульфитное секвенирование не позволяет различить 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин. Это означает, что результат бисульфитного секвенирования больше нельзя определять только как метилирование ДНК, поскольку он представляет собой смесь 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. Развитие секвенирования оксидативного бисульфита с помощью Tet Чуан Хэ в Чикагском университете теперь могут различать две модификации при разрешении единой базы.[25]

Неполная конверсия

Бисульфитное секвенирование основано на превращении каждого неметилированного остатка цитозина в урацил. Если преобразование неполное, последующий анализ будет неправильно интерпретировать непревращенные неметилированные цитозины как метилированные цитозины, что приведет к ложный положительный результат результаты для метилирования. Только цитозины в одноцепочечной ДНК подвержены атаке бисульфита, поэтому денатурация ДНК, проходящей анализ, имеет решающее значение.[2] Важно убедиться, что параметры реакции, такие как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и позволяют проводить полное преобразование. Встраивание ДНК в агароза Сообщалось, что гель улучшает скорость превращения, сохраняя нити ДНК физически разделенными.[26]

Разрушение ДНК при обработке бисульфитом

Основной проблемой при секвенировании бисульфитов является деградация ДНК, которая происходит одновременно с превращением. Условия, необходимые для полной конверсии, такие как длительное время инкубации, повышенная температура и высокая концентрация бисульфита, могут привести к деградации примерно 90% инкубированной ДНК.[27] Учитывая, что исходное количество ДНК часто ограничено, такая обширная деградация может быть проблематичной. Деградация происходит как депуринизация что приводит к случайным обрывам прядей.[28] Следовательно, чем дольше желаемое ПЦР ампликон, тем более ограниченным будет количество интактных молекул-шаблона. Это может привести к сбою амплификации ПЦР или потере количественно точной информации об уровнях метилирования в результате ограниченного отбор проб шаблонных молекул. Таким образом, важно оценить степень деградации ДНК в результате используемых условий реакции и рассмотреть, как это повлияет на желаемый ампликон. Также можно использовать методы для минимизации деградации ДНК, например циклическое изменение температуры инкубации.[28]

Другие проблемы

Потенциально значительная проблема после обработки бисульфитом - неполная десульфирование из пиримидин остатки из-за недостаточного подщелачивания раствора. Это может помешать некоторым ДНК-полимеразы, затрудняя последующую ПЦР. Однако этой ситуации можно избежать, отслеживая pH раствора, чтобы гарантировать, что десульфирование будет полным.[2]

И последнее беспокойство вызывает то, что обработка бисульфитом значительно снижает уровень сложности образца, что может быть проблематичным, если необходимо провести несколько реакций ПЦР (2006).[5] Грунтовка дизайн сложнее, и неуместная перекрестная гибридизация более часта.

Приложения: анализ метилирования по всему геному

Достижения в области бисульфитного секвенирования привели к возможности их применения в геном в широком масштабе, где ранее глобальное измерение метилирования ДНК было возможно только с использованием других методов, таких как Геномное сканирование рестрикционных ориентиров. Отображение человека эпигеном рассматривается многими учеными как логическое продолжение завершения Проект "Геном человека".[29][30] Эта эпигеномная информация будет важна для понимания того, как функция генетической последовательности реализуется и регулируется. Поскольку эпигеном менее стабилен, чем геном, считается, что он важен для взаимодействие генов с окружающей средой.[31]

Эпигеномное картирование по своей сути сложнее, чем секвенирование генома однако, поскольку эпигеном гораздо более изменчив, чем геном. Эпигеном человека меняется с возрастом, различается в разных тканях, изменяется под воздействием факторов окружающей среды и проявляет отклонения при заболеваниях. Однако такое обширное эпигеномное картирование, представляющее разные возрасты, типы тканей и болезненные состояния, могло бы дать ценную информацию о нормальной функции эпигенетический отметки, а также механизмы, приводящие к старению и болезням.

Прямые преимущества эпигеномного картирования включают вероятные достижения в клонирование технологии. Считается, что неспособность произвести клонированных животных с нормальной жизнеспособностью и продолжительностью жизни является результатом несоответствующих образцов эпигенетических меток. Кроме того, паттерны аберрантного метилирования хорошо описаны во многих раки. Глобальное гипометилирование приводит к снижению стабильности генома, в то время как локальное гиперметилирование ген-супрессор опухоли промоутеры часто объясняет их Потеря функции. Конкретные паттерны метилирования указывают на конкретные типы рака, есть прогностический ценность, и может помочь выбрать лучший курс лечения.[30]

Во всем мире ведутся широкомасштабные усилия по картированию эпигеномов, которые были организованы в рамках Проект человеческого эпигенома.[31] Это основано на многоуровневой стратегии, при которой бисульфитное секвенирование используется для получения профилей метилирования с высоким разрешением для ограниченного числа эталонных эпигеномов, в то время как менее тщательный анализ выполняется на более широком спектре образцов. Этот подход предназначен для максимизации понимания, полученного из заданного количества ресурсов, поскольку картирование всего генома с высоким разрешением остается дорогостоящим мероприятием.

Было показано, что анализ генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) сильно смещен при применении к данным метилирования с высокой пропускной способностью (например, бисульфитное секвенирование по всему геному); Было высказано предположение, что это можно исправить, используя перестановки меток образца или используя статистическую модель для контроля различий в количестве зондов CpG / сайтов CpG, нацеленных на каждый ген.[32]

Окислительное бисульфитное секвенирование

5-Метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин читаются как C в бисульфитном секвенировании.[24] Окислительное бисульфитное секвенирование - это метод различения 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина при разрешении по одному основанию. В этом методе используется специфическое (с помощью Tet) химическое окисление 5-гидроксиметилцитозина до 5-формилцитозина, который впоследствии превращается в урацил во время обработки бисульфитом.[33] Единственное основание, которое затем читается как C, - это 5-метилцитозин, что дает карту истинного статуса метилирования в образце ДНК. Уровни 5 ‑ гидроксиметилцитозина также можно определить количественно путем измерения разницы между бисульфитным и окислительным бисульфитным секвенированием.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Чаттерджи А., Стоквелл П.А., Роджер Э.Дж. и Морисон И.М. 2012. Сравнение программного обеспечения для выравнивания данных о бисульфитных последовательностях всего генома. Исследования нуклеиновых кислот 40 (10): e79.
  2. ^ а б c Фрага М.Ф., Эстеллер М. (сентябрь 2002 г.). «Метилирование ДНК: профиль методов и приложений». Биотехнологии. 33 (3): 632, 634, 636–49. Дои:10.2144 / 02333rv01. PMID  12238773.
  3. ^ Эль-Маарри О (2003). «Методы: метилирование ДНК». Пероксисомные расстройства и регуляция генов. Успехи экспериментальной медицины и биологии. 544. С. 197–204. Дои:10.1007/978-1-4419-9072-3_23. ISBN  978-0-306-48174-1. PMID  14713229.
  4. ^ Laird PW (апрель 2003 г.). «Сила и перспективы маркеров метилирования ДНК». Обзоры природы. Рак. 3 (4): 253–66. Дои:10.1038 / nrc1045. PMID  12671664. S2CID  19574628.
  5. ^ а б Каллинан П.А., Файнберг А.П. (апрель 2006 г.). «Возникающая наука эпигеномика». Молекулярная генетика человека. 15 ТУ № 1 (90001): Р95-101. Дои:10.1093 / hmg / ddl095. PMID  16651376.
  6. ^ а б Фроммер М., Макдональд Л. Е., Миллар Д. С., Коллис С. М., Ватт Ф., Григг Г. В. и др. (Март 1992 г.). «Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (5): 1827–31. Bibcode:1992PNAS ... 89.1827F. Дои:10.1073 / pnas.89.5.1827. ЧВК  48546. PMID  1542678.
  7. ^ Колелла С., Шен Л., Баггерли К.А., Исса Дж. П., Крахе Р. (июль 2003 г.). «Чувствительный и количественный универсальный пиросеквенирующий анализ метилирования сайтов CpG». Биотехнологии. 35 (1): 146–50. Дои:10.2144 / 03351md01. PMID  12866414.
  8. ^ Tost J, Dunker J, Gut IG (июль 2003 г.). «Анализ и количественная оценка различных положений метилирования в островках CpG с помощью пиросеквенирования». Биотехнологии. 35 (1): 152–6. Дои:10.2144 / 03351md02. PMID  12866415.
  9. ^ Wong HL, Byun HM, Kwan JM, Campan M, Ingles SA, Laird PW, Yang AS (декабрь 2006 г.). «Быстрый и количественный метод анализа аллель-специфического метилирования ДНК». Биотехнологии. 41 (6): 734–9. Дои:10.2144/000112305. PMID  17191619.[постоянная мертвая ссылка ]
  10. ^ Бьянко Т., Хасси Д., Добрович А. (1999). «Чувствительный к метилированию однонитевой конформационный анализ (MS-SSCA): быстрый метод скрининга и анализа метилирования». Человеческая мутация. 14 (4): 289–93. Дои:10.1002 / (SICI) 1098-1004 (199910) 14: 4 <289 :: AID-HUMU3> 3.0.CO; 2-A. PMID  10502775.
  11. ^ Войдач Т.К., Добрович А. (2007). «Чувствительное к метилированию плавление с высоким разрешением (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования». Исследования нуклеиновых кислот. 35 (6): e41. Дои:10.1093 / нар / гкм013. ЧВК  1874596. PMID  17289753.
  12. ^ Гонсалго М.Л., Джонс П.А. (июнь 1997 г.). «Быстрое количественное определение различий в метилировании в конкретных сайтах с использованием чувствительного к метилированию однонуклеотидного праймера (Ms-SNuPE)». Исследования нуклеиновых кислот. 25 (12): 2529–31. Дои:10.1093 / nar / 25.12.2529. ЧВК  146734. PMID  9171109.
  13. ^ Ульманн К., Бринкманн А., Тольят М.Р., Риттер Х., Нюрнберг П. (декабрь 2002 г.). «Оценка потенциального эпигенетического биомаркера с помощью количественного анализа метил-однонуклеотидного полиморфизма». Электрофорез. 23 (24): 4072–9. Дои:10.1002 / elps.200290023. PMID  12481262. S2CID  43737807.
  14. ^ Матин М.М., Баумер А., Хорнби Д.П. (октябрь 2002 г.). «Аналитический метод обнаружения различий в метилировании в конкретных хромосомных локусах с использованием удлинения праймера и ВЭЖХ с обращенной фазой ионных пар». Человеческая мутация. 20 (4): 305–11. Дои:10.1002 / humu.10118. PMID  12325026.
  15. ^ Эрих М., Нельсон М.Р., Станссенс П., Забо М., Лилоглу Т., Ксинарианос Г. и др. (Ноябрь 2005 г.). «Количественный высокопроизводительный анализ паттернов метилирования ДНК с помощью оснований специфического расщепления и масс-спектрометрии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (44): 15785–90. Bibcode:2005ПНАС..10215785E. Дои:10.1073 / pnas.0507816102. ЧВК  1276092. PMID  16243968.
  16. ^ Герман Дж. Г., Графф JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Байлин С.Б. (Сентябрь 1996 г.). «Метилирование-специфическая ПЦР: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 93 (18): 9821–6. Bibcode:1996PNAS ... 93.9821H. Дои:10.1073 / пнас.93.18.9821. ЧВК  38513. PMID  8790415.
  17. ^ Идс СА, Даненберг К.Д., Каваками К., Сальц Л. Б., Блейк С., Шибата Д. и др. (Апрель 2000 г.). «MethyLight: высокопроизводительный анализ для измерения метилирования ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 28 (8): 32e – 0. Дои:10.1093 / nar / 28.8.e32. ЧВК  102836. PMID  10734209.
  18. ^ Рэнд К., Ку В., Хо Т, Кларк SJ, Моллой П. (июнь 2002 г.). «Конверсионно-специфическое обнаружение метилирования ДНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ConLight-MSP) во избежание ложных срабатываний». Методы. 27 (2): 114–20. Дои:10.1016 / S1046-2023 (02) 00062-2. PMID  12095268.
  19. ^ Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L (октябрь 2002 г.). «Анализ метилирования ДНК на основе подходов с высокой пропускной способностью кривой плавления». Геномика. 80 (4): 376–84. Дои:10.1006 / geno.2002.6851. PMID  12376091.
  20. ^ Кристенсен Л.С., Микеска Т., Крипуй М., Добрович А. (апрель 2008 г.). «Чувствительный анализ плавления после специфической ПЦР для метилирования в реальном времени (SMART-MSP): высокопроизводительное количественное определение метилирования ДНК без зондов». Исследования нуклеиновых кислот. 36 (7): e42. Дои:10.1093 / nar / gkn113. ЧВК  2367707. PMID  18344521.
  21. ^ Адорьян П., Дистлер Дж., Липшер Э., Модель F, Мюллер Дж., Пелет С. и др. (Март 2002 г.). «Прогнозирование и обнаружение класса опухоли с помощью анализа метилирования ДНК на основе микрочипов». Исследования нуклеиновых кислот. 30 (5): 21e – 21. Дои:10.1093 / nar / 30.5.e21. ЧВК  101257. PMID  11861926.
  22. ^ Тахилиани М., Кох К.П., Шен Й., пастор В.А., Бандуквала Х., Брудной и др. Превращение 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в ДНК млекопитающих партнером MLL TET1. Наука. 2009;324(5929):930-5.
  23. ^ Kriaucionis S, Heintz N. Основание ядерной ДНК 5-гидроксиметилцитозин присутствует в нейронах Пуркинье и в мозге. Наука, 2009; 324 (5929): 929-30.
  24. ^ а б Хуан Ю., пастор В. А., Шен Ю., Тахилиани М., Лю Д. Р., Рао А. Поведение 5-гидроксиметилцитозина в бисульфитном секвенировании. PLOS ONE.2010; 5 (1): e8888.
  25. ^ Yu, M., Hon, G.C., Szulwach, K. E., Song, C., Jin, P., Ren, B., He, C. Секвенирование 5-гидроксиметилцитозина с помощью бисульфита с помощью Tet. Nat. Протоколы 2012, 7, 2159.
  26. ^ Олек А., Освальд Дж., Уолтер Дж. (Декабрь 1996 г.). «Модифицированный и улучшенный метод анализа метилирования цитозина на основе бисульфита». Исследования нуклеиновых кислот. 24 (24): 5064–6. Дои:10.1093 / nar / 24.24.5064. ЧВК  146326. PMID  9016686.
  27. ^ Грунау С., Кларк С.Дж., Розенталь А. (июль 2001 г.). «Бисульфитное геномное секвенирование: систематическое исследование важнейших экспериментальных параметров». Исследования нуклеиновых кислот. 29 (13): E65-5. Дои:10.1093 / nar / 29.13.e65. ЧВК  55789. PMID  11433041.
  28. ^ а б Эрих М., Цолл С., Сур С., Ван ден Бум Д. (2007). «Новый метод точной оценки качества ДНК после обработки бисульфитом». Исследования нуклеиновых кислот. 35 (5): e29. Дои:10.1093 / нар / gkl1134. ЧВК  1865059. PMID  17259213.
  29. ^ Эстеллер М (июнь 2006 г.). «Необходимость проекта эпигенома человека». Канцерогенез. 27 (6): 1121–5. Дои:10.1093 / carcin / bgl033. PMID  16699174.
  30. ^ а б Брэдбери Дж (декабрь 2003 г.). «Проект эпигенома человека - запущен». PLOS Биология. 1 (3): E82. Дои:10.1371 / journal.pbio.0000082. ЧВК  300691. PMID  14691553.
  31. ^ а б Джонс PA, Martienssen R (декабрь 2005 г.). "План проекта человеческого эпигенома: семинар по человеческому эпигеному AACR". Исследования рака. 65 (24): 11241–6. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3865. PMID  16357125.
  32. ^ Гилехер П., Хартнетт Л., Иган Л.Дж., Голден А., Раджа Али Р.А., Сойхе С. (август 2013 г.). «Анализ генома сильно искажен при применении к данным метилирования всего генома». Биоинформатика. 29 (15): 1851–7. Дои:10.1093 / биоинформатика / btt311. PMID  23732277.
  33. ^ Бут М.Дж., Бранко М.Р., Фиц Дж., Оксли Д., Крюгер Ф., Рейк В. и др. количественное секвенирование 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина при разрешении одного основания. Наука. 2012;336(6083):934-7.

внешняя ссылка