Пиросеквенирование - Pyrosequencing

Пиросеквенирование это метод Секвенирование ДНК (определение порядка нуклеотиды в ДНК) на основе принципа «секвенирования путем синтеза», при котором секвенирование выполняется путем обнаружения нуклеотида, включенного ДНК-полимераза. Пиросеквенирование основано на обнаружении света на основе цепной реакции, когда пирофосфат выпущен. Отсюда и название пиросеквенирование.

Принцип пиросеквенирования был впервые описан в 1993 году.[1] к Бертил Петтерссон, Матиас Улен и Пол Нюрен путем объединения твердофазное секвенирование метод[2] с помощью стрептавидин покрытые оболочкой магнитные шарики с рекомбинантной ДНК-полимеразой, лишенной экзонуклеазной активности от 3 до 5 (корректура) и детектирование люминесценции с использованием люцифераза светлячков фермент.[3] Смесь трех ферменты (ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза и светлячок люцифераза ) и нуклеотид (dNTP ) добавляются к одноцепочечной ДНК, которую необходимо секвенировать, и за включением нуклеотида следует измерение испускаемого света. Интенсивность света определяет, были ли включены 0, 1 или более нуклеотидов, таким образом показывая, сколько комплементарных нуклеотидов присутствует на матричной цепи. Смесь нуклеотидов удаляют перед добавлением следующей смеси нуклеотидов. Этот процесс повторяется с каждым из четырех нуклеотидов, пока не будет определена последовательность ДНК одноцепочечной матрицы.

Второй метод пиросеквенирования на основе раствора был описан в 1998 году.[4] к Мостафа Ронаги, Матиас Улен и Пол Нюрен. В этом альтернативном методе дополнительный фермент апираза вводится для удаления нуклеотидов, которые не включены в ДНК-полимеразу. Это позволило смеси ферментов, включающей ДНК-полимераза, то люцифераза и апираза добавляются в начале и сохраняются на протяжении всей процедуры, что обеспечивает простую настройку, подходящую для автоматизации. Автоматизированный прибор, основанный на этом принципе, был представлен на рынке в следующем году компанией Pyrosequencing.

Третий микрофлюидный вариант метода пиросеквенирования был описан в 2005 году.[5] к Джонатан Ротберг и сотрудники компании 454 Науки о жизни. Этот альтернативный подход к пиросеквенированию был основан на первоначальном принципе прикрепления ДНК, подлежащей секвенированию, к твердой подложке, и они показали, что секвенирование может быть выполнено очень параллельным образом с использованием микрофабрика микрочип. Это позволило осуществить высокопроизводительное секвенирование ДНК, и на рынке был представлен автоматизированный прибор. Он стал первым секвенсорным инструментом следующего поколения, открывшим новую эру в геномика исследования, с быстро падающими ценами на Секвенирование ДНК позволяя секвенирование всего генома по доступным ценам.

Процедура

Как работает пиросеквенирование
На диаграмме показано, как работает пиросеквенирование.

«Секвенирование путем синтеза» включает взятие одной цепи ДНК для секвенирования и затем ферментативный синтез ее комплементарной цепи. Метод пиросеквенирования основан на обнаружении активности ДНК-полимераза (фермент, синтезирующий ДНК) с другим хемолюминесцентный фермент. По сути, метод позволяет секвенировать одну цепочку ДНК синтезируя дополнительную цепь вдоль нее, по одной паре оснований за раз, и определяя, какое основание было фактически добавлено на каждом этапе. Матричная ДНК неподвижна, и растворы A, C, G и T нуклеотиды последовательно добавляются и удаляются из реакции. Свет появляется только тогда, когда раствор нуклеотидов дополняет первую непарную основу матрицы. Последовательность растворов, которые производят хемилюминесцентные сигналы, позволяет определить последовательность матрицы.[6]

Для версии пиросеквенирования на основе раствора одноцепочечная ДНК (оцДНК ) шаблон гибридизируется с секвенированием грунтовка и инкубировали с ферментами ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза, а с подложками аденозин 5´ фосфосульфат (APS) и люциферин.

  1. Добавление одного из четырех дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ ) (dATPαS, который не является субстратом для люциферазы, добавлен вместо dATP, чтобы избежать шума) инициирует второй этап. ДНК-полимераза включает правильные комплементарные dNTP в матрицу. Это включение выпускает пирофосфат (PPi).
  2. АТФ-сульфурилаза превращает PPi в АТФ в присутствии фосфосульфата аденозина 5´. Этот АТФ действует как субстрат для опосредованного люциферазой преобразования люциферина в оксилюциферин, который генерирует видимый свет в количествах, пропорциональных количеству. Свет, образующийся в реакции, катализируемой люциферазой, обнаруживается камерой и анализируется программой.
  3. Невключенные нуклеотиды и АТФ расщепляются под действием апираза, и реакция может возобновиться с другим нуклеотидом.

Процесс можно представить следующими уравнениями:

  • PPi + APS → ATP + сульфат (катализируется АТФ-сульфурилазой);
  • АТФ + люциферин + O2 → AMP + PPi + оксилюциферин + CO2 + hv (катализируется люциферазой);

куда:

  • PPi - пирофосфат
  • APS представляет собой аденозин-5-фосфосульфат;
  • АТФ - аденозинтрифосфат;
  • O2 - молекула кислорода;
  • АМФ представляет собой монофосфат аденозина;
  • CO2 - диоксид углерода;
  • hv светлый.

Ограничения

В настоящее время ограничением метода является то, что длины отдельных считываний последовательности ДНК находятся в районе 300-500 нуклеотидов, что меньше длины 800-1000, получаемой с помощью обрыв цепи методы (например, секвенирование по Сэнгеру). Это может сделать процесс сборка генома более сложно, особенно для последовательностей, содержащих большое количество повторяющаяся ДНК. Отсутствие корректуры ограничивает точность этого метода.

Коммерциализация

Компания Пиросеквенирование AB в Упсала, Швеция была основана с венчурный капитал предоставленный HealthCap с целью коммерциализации оборудования и реагентов для секвенирования коротких участков ДНК с использованием метода пиросеквенирования. Пиросеквенирование AB было внесено в список Стокгольмская фондовая биржа в 1999 г. был переименован в Биотаж в 2003 году. Бизнес-направление пиросеквенирования было приобретено Qiagen в 2008 г. Лицензия на технологию пиросеквенирования получила 454 Науки о жизни. 454 разработала технологию пиросеквенирования на основе массивов, которая стала платформой для крупномасштабное секвенирование ДНК, включая секвенирование генома и метагеномика.

Рош объявила о прекращении производства платформы секвенирования 454 в 2013 году, когда ее технология стала неконкурентоспособной.[7]

Рекомендации

  1. ^ Найрен, Петерссон и Улен (1993) «Минисеквенирование твердофазной ДНК с помощью ферментативного люминометрического анализа обнаружения неорганического пирофосфата» Analytical Biochemistry 208 (1), 171-175, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024
  2. ^ Улен (1989) «Магнитное разделение ДНК» Nature 340: 733-4, https://doi.org/10.1038/340733a0
  3. ^ Найрен и Лундин (1985) «Ферментативный метод непрерывного мониторинга синтеза неорганического пирофосфата» Analytiocal Biochemistry 151 (2): 504-509. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8
  4. ^ Ронаги, Улен и Нирен (1998) «Метод секвенирования на основе пирофосфата в реальном времени» Наука. 281 (5375): 363. https://doi.org/10.1126/science.281.5375.363 .
  5. ^ Marguiles и др. (2005) «Секвенирование генома в микроизготовленных пиколитровых реакторах высокой плотности» Nature 437, 376-380. https://doi.org/doi:10.1038/nature03959;
  6. ^ QIAGEN. «Обзор технологии и платформы пиросеквенирования». Получено 4 августа 2017.
  7. ^ Холлмер, Марк (17 октября 2013 г.). «Рош закроет 454 Life Sciences, поскольку это снижает внимание к секвенированию генов». Жестокая биотехнология.

дальнейшее чтение