Относительные единицы флуоресценции - Relative fluorescence units - Wikipedia

Условия "относительные единицы флуоресценции«(РФС) и»RFU пик"см. измерения в электрофорез методы, например для ДНК анализ. «Единица относительной флуоресценции» - это единица измерения измерение используется в анализе, который использует флуоресценция обнаружение.[1] Флуоресценция обнаруживается с помощью заряженное связанное устройство (CCD) матрица, когда меченые фрагменты, которые разделены внутри капилляра с помощью электрофореза, возбуждаются от лазер свет и путешествовать через окно обнаружения. Компьютерная программа измеряет результаты, определяя количество или размер фрагментов в каждой точке данных по уровню интенсивности флуоресценции.[1] Образцы, которые содержат большее количество амплифицированной ДНК, будут иметь более высокие соответствующие значения RFU.[2][3]

«Пик RFU» - это точка относительного максимума на графике проанализированных данных. Данные могут быть нормализованы для ввода ДНК или дополнительных нормализующих генов. Высота RFU может составлять от 0 до нескольких тысяч.

ДНК ПЦР анализ

Измерения RFU используются для ДНК-профилирование, в полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР). Двумя распространенными методами обнаружения продуктов в ПЦР в реальном времени являются: (1) неспецифический флуоресцентные красители который вставлять с любой двухцепочечной ДНК и (2) специфичной для последовательности ДНК-зонды состоящий из олигонуклеотиды которые помечены флуоресцентный репортер, который разрешает обнаружение только после гибридизация зонда с его комплементарной ДНК-мишенью. Часто ПЦР в реальном времени сочетается с обратная транскрипция количественно оценить информационная РНК и Некодирующая РНК в клетках или тканях.

Пиковые пороги RFU

Высота пика RFU зависит от количества анализируемой ДНК. Когда количество ДНК очень низкое, может быть трудно отделить истинный низкоуровневый пик RFU от сигнал шум или другие технические артефакты.[4] В результате многие лаборатории судебно-медицинской экспертизы ДНК установили минимальные уровни высоты пика RFU при «подсчете» анализа аллели.[4]

Не существует твердых отраслевых правил для установления минимальных пороговых значений RFU.[4] Каждая лаборатория, как правило, устанавливает свои собственные пороговые уровни как один из аспектов своей конкретной процедуры валидации. Многие лаборатории установили как нижний, так и верхний пороги для интерпретации данных, как окно минимальных и максимальных показаний.[4]

Некоторые пороговые уровни могут быть получены экспериментально на основе известных значений оборудования. отношения сигнал / шум или может быть определен порог в соответствии с опубликованными данными или спецификациями производителя.[4] Компания Applied Biosystems, Inc. (ABI), которая продает наиболее широко используемое оборудование для набора текста STR, рекомендовала минимальную высоту пика 150 RFU, советуя с осторожностью оценивать пики ниже этого уровня. Однако многие лаборатории судебной экспертизы, имеющие системы ABI, определили более низкие пороговые значения, часто только от 50 до 100 RFU, как это определено их собственными исследованиями.[4]

На выбор лабораторией пороговых значений может влиять множество различных факторов.[4] Например, в определенных юрисдикциях могут быть нормативные акты. Кроме того, разные инструменты различаются по чувствительности (например, плита гель инструменты менее чувствительны, чем капиллярный электрофорез (CE) инструменты). Также известно, что отдельные инструменты определенного типа модели различаются по производительности (например, различия между различными устройствами ABI 310, все одной модели). Инструменты для капиллярного электрофореза обычно обеспечивают лучшее разрешение по сравнению с системами на основе геля, а также обладают большей чувствительностью. Кроме того, некоторые лаборатории устанавливают разные пороговые стандарты в зависимости от того, какие инструменты в лаборатории используются для анализа.[4]

Установка верхнего максимального порога имеет решающее значение при анализе данных ДНК в большом количестве образцов.[4] Образцы с большим количеством амплифицированной ДНК будут сообщать о высоких уровнях RFU, которые могут перенасыщать чувствительность прибора для измерения результатов. В таких случаях точное измерение относительной высоты и / или площади пиков может оказаться недостижимым. Перенасыщение может быть проблемой при анализе смешанных образцов.[4]

Рекомендации

  1. ^ а б «Единица относительной флуоресценции (RFU)», DNA.gov: Глоссарий, апрель 2011 г., веб-страница: ДНК-правительство-РФС.
  2. ^ «Пороги», NFSTC.org, 2010, веб-страница: [1].
  3. ^ Gertsch J, Güttinger M, Sticher O, Heilmann J (2002). «Относительное количественное определение уровней мРНК в Т-клетках Jurkat с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ОТ-ПЦР): новые возможности для скрининга противовоспалительных и цитотоксических соединений». Pharm Res. 19 (8): 1236–1243. Дои:10.1023 / А: 1019818814336. PMID  12240952.
  4. ^ а б c d е ж грамм час я j «Продвижение правосудия с помощью технологии ДНК», Национальный центр криминалистических технологий (NFSTC), 2011, веб-сайт: NFS2.