Обращенно-фазовая хроматография - Reversed-phase chromatography

Обращенно-фазовая хроматография (также называется RPC, обращенно-фазовая хроматография, или гидрофобная хроматография) включает любые хроматографический метод, который использует гидрофобный стационарная фаза.[1]RPC относится к жидкостной (а не газовой) хроматографии.

Стационарные фазы

В 1970-е годы большинство жидкостная хроматография был выполнен с использованием прочная поддержка стационарная фаза (также называемая колонкой), содержащая немодифицированные кремнезем или глинозем смолы. Этот тип техники теперь называется нормально-фазовая хроматография. Поскольку стационарная фаза гидрофильный в этом методе молекулы с гидрофильными свойствами, содержащиеся в Мобильная фаза будет иметь высокое сродство к стационарной фазе и, следовательно, будет адсорбировать к насадке колонки. Гидрофобный молекулы испытывают меньшее сродство к насадке колонки и будут проходить через элюированный и обнаружен первым. Элюирование гидрофильных молекул, адсорбированных на насадке колонки, требует использования более гидрофильных или более полярный растворители в подвижной фазе, чтобы сместить распределение частиц в неподвижной фазе в сторону распределения подвижной фазы.

Обращенно-фазовая хроматография - это метод, использующий алкил цепочки, ковалентно связанные с частицами неподвижной фазы, чтобы создать гидрофобный неподвижная фаза, которая имеет более сильное сродство к гидрофобным или менее полярным соединениям. Использование гидрофобной неподвижной фазы по существу является противоположностью хроматографии с нормальной фазой, поскольку полярность подвижной и неподвижной фаз поменялась местами - отсюда и термин хроматография с обращенной фазой.[2][3] В обращенно-фазовой хроматографии используется полярный (водный ) Мобильная фаза. В результате гидрофобные молекулы в полярной подвижной фазе стремятся адсорбироваться на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофобные молекулыфилик Молекулы подвижной фазы проходят через колонку и элюируются первыми.[2][4] Гидрофобные молекулы могут быть элюированы из колонки путем уменьшения полярности подвижной фазы с использованием органического (неполярного) растворителя, который снижает гидрофобные взаимодействия. Чем более гидрофобна молекула, тем сильнее она будет связываться с неподвижной фазой и тем выше концентрация органического растворителя, необходимая для элюирования молекулы.

Многие математические и экспериментальные соображения, используемые в других хроматографических методах, также применимы к RPC (например, разделение разрешающая способность зависит от длины столбца). Его можно использовать для разделения самых разных молекул. Обычно он не используется для разделения белков, потому что органические растворители, используемые в RPC, могут денатурировать многие белки. По этой причине для разделения белков чаще используется нормальная фазовая хроматография. Однако денатурация белков может быть полезной при последующем анализе образцов, полученных с помощью хроматографии. Если на анализируемых белках проводится ферментативное расщепление трипсином, для этого больше подходит линеаризованный белок. Следовательно, денатурация белков с использованием подходящих растворителей, которые вызывают разворачивание белков, на самом деле может быть преднамеренной перед взятием фракционированного образца с помощью масс-спектрометрии.

Сегодня RPC - это часто используемый аналитический метод. Существует множество стационарных фаз, доступных для использования в RPC, что обеспечивает большую гибкость при разработке методов разделения.

Стационарные фазы на основе кремнезема

Любой инертный полярный вещество, которое обеспечивает достаточную упаковку, можно использовать для обращенно-фазовой хроматографии. Самая популярная колонка представляет собой диоксид кремния, связанный с октадецильными углеродными цепями (C18) (классификация USP L1).[5] Далее следуют диоксид кремния, связанный с C8 (L7), чистый диоксид кремния (L3), диоксид кремния с циано-связью (L10) и диоксид кремния с фенильной связью (L11). Обратите внимание, что C18, C8 и фенил являются специальными смолами с обращенной фазой, в то время как цианоколонки могут использоваться в режиме с обращенной фазой в зависимости от аналита и условий подвижной фазы. Не все колонки C18 обладают одинаковыми удерживающими свойствами. Функционализацию поверхности диоксида кремния можно проводить в мономерной или полимерной реакции с различными короткоцепочечными органосиланами, используемыми на второй стадии для покрытия оставшихся силанольных групп (конец ). Хотя общий механизм удерживания остается неизменным, небольшие различия в химическом составе поверхности различных неподвижных фаз приведут к изменениям селективности.

Современные колонны имеют разную полярность. ПФП - пентафторфенил. CN - циано. NH2 - это амино. ODS - октадецил или C18. ODCN представляет собой колонку смешанного режима, состоящую из C18 и нитрила. SCX - это сильный катионный обмен (используется для разделения органических аминов). SAX - это сильный анионный обмен (используется для разделения соединений карбоновых кислот).

Мобильные фазы

Смеси воды или водных буферов и органических растворителей используются для элюирования аналитов из обращенно-фазовой колонки.[2] Растворители должны смешиваться с водой, и наиболее часто используемые органические растворители: ацетонитрил, метанол и тетрагидрофуран (THF). Могут использоваться другие растворители, такие как этанол или 2-пропанол (изопропиловый спирт). Элюирование можно проводить изократически (состав воды и растворителя не меняется в процессе разделения) или с использованием градиента раствора (состав воды и растворителя изменяется в процессе разделения, обычно за счет уменьшения полярности). PH подвижной фазы может иметь важное значение для удержания аналита и может изменять селективность некоторых аналитов.

Заряженные аналиты могут быть разделены на обращенно-фазовой колонке с использованием ионная пара (также называемое ионным взаимодействием). Этот метод известен как обращенно-фазовая ионно-парная хроматография.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ ИЮПАК, Сборник химической терминологии 2-е изд. («Золотая книга») (1997). Исправленная онлайн-версия: (2006–) "обращенно-фазовая хроматография ". Дои:10.1351 / goldbook.R05376
  2. ^ а б c Акуль Мехта (27 декабря 2012 г.). «Принцип обращенно-фазовой хроматографии ВЭЖХ / УЭЖХ (с анимацией)». PharmaXChange. Получено 10 января 2013.
  3. ^ И. Молнар и К. Хорват (сентябрь 1976 г.). «Обращенно-фазовая хроматография полярных биологических веществ: разделение катехиновых соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». Клиническая химия. 22 (9): 1497–1502. PMID  8221. Получено 10 января 2013.
  4. ^ (Клиническая биохимия, Т. В. Хрубей, 54)
  5. ^ Хроматографические реагенты Фармакопеи США 2007-2008: Используется в Фармакопейном форуме и Фармакопейном форуме Фармакопеи США.. Фармакопея США. 2007 г.

внешняя ссылка

  • Столы резюмируя различные типы обратных фаз и информацию о процессе функционализации