Транскрипция второго тура - Run-off transcription

А транскрипция второго тура проба - пробирка в молекулярная биология который проводится in vitro для определения положения сайта начала транскрипции (1 пара оснований выше) конкретного промотора, а также его точности и скорости in vitro транскрипция.[1][2][3]

Последующая транскрипция может быть использована для количественного измерения влияния изменения промоторных областей на уровни транскрипции in vitro.[1][2][4] Однако из-за своей природы in vitro этот анализ не может точно предсказать скорость транскрипции клеточно-специфических генов, в отличие от анализов in vivo, таких как ядерный прогон.[1][2]

Для проведения последующего анализа транскрипции интересующий ген, включая промоутер, клонируется в плазмида[4]. Плазмида переваривается при известной рестрикционный фермент вырезать сайт ниже стартового сайта транскрипции так, чтобы ожидаемый мРНК сточный продукт легко отделить гель-электрофорез.[1][2][4]Перед проведением этого анализа ДНК необходимо тщательно очистить.[1] [2] Чтобы инициировать транскрипцию, радиоактивно меченый UTP, другой нуклеотиды, и РНК-полимераза добавляются к линеаризованной ДНК.[1][2] Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не достигнет конца ДНК, где она просто «убегает» от матрицы ДНК, в результате чего образуется фрагмент мРНК определенной длины.[1][2] Затем этот фрагмент можно разделить с помощью гель-электрофореза вместе со стандартами размера и провести авторадиографию.[1][2][4] Соответствующий размер полосы будет представлять размер мРНК от сайта разреза рестрикционным ферментом до сайта начала транскрипции (+1).[4] Интенсивность полосы будет указывать на количество продуцируемой мРНК.[4]

Кроме того, его можно использовать для определения того, осуществляется ли транскрипция при определенных условиях (то есть в присутствии различных химических веществ).[5]


Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час Loewenstein, P.M .; Песня, C. Z .; Грин, М. (2007). «Использование транскрипции in vitro для исследования регуляторных функций вирусных белковых доменов». Методы молекулярной медицины. 131: 15–31. PMID  17656772.
  2. ^ а б c d е ж грамм час "Вторая транскрипция". Молекулярная станция. Архивировано из оригинал 22 апреля 2014 г.. Получено 16 апреля, 2014.
  3. ^ Lelandais, C; Gutierres, S; Матье, C; Ведель, Ф; Ремакл, С; Maréchal-Drouard, L; Бреннике, А; Связующее, S; Chétrit, P (1996). «Промоторный элемент, активный в исходной транскрипции, контролирует экспрессию двух цистронов генов nad и rps в митохондриях Nicotiana sylvestris». Исследования нуклеиновых кислот. 24 (23): 4798–804. Дои:10.1093 / nar / 24.23.4798. ЧВК  146301. PMID  8972868.
  4. ^ а б c d е ж Эллисон, Лизабет. «Фундаментальная молекулярная биология, глава 11» (PDF). BlackWell Publishing. Получено 18 апреля, 2014.
  5. ^ Санчес, Альваро; Осборн, Мелиса Л .; Фридман, Ларри Дж .; Кондев, Джейн; Геллес, Джефф (2011). «Механизм репрессии транскрипции на бактериальном промоторе с помощью анализа одиночных молекул». Журнал EMBO. 30 (19): 3940–3946. Дои:10.1038 / emboj.2011.273. ЧВК  3209775. PMID  21829165.