SOS хромотест - SOS chromotest

Обзор использования SOS-ответа для тестирования генотоксичности

В SOS хромотест это биологический тест для оценки генотоксичный потенциал химических соединений. Тест представляет собой колориметрический анализ, который измеряет экспрессию генов, индуцированную генотоксическими агентами в кишечная палочка, посредством слияния со структурным геном β-галактозидаза. Тест проводится в течение нескольких часов в колонках 96-луночного микропланшета с увеличивающимися концентрациями тестируемых образцов. Этот тест был разработан как практическое дополнение или альтернатива традиционному Тест Эймса проба для генотоксичность, который включает выращивание бактерий на чашках с агаром и сравнение частоты естественных мутаций с частотой мутаций бактерий, подвергшихся воздействию потенциально мутагенных соединений или образцов. Хромотест SOS сопоставим по точности и чувствительности с установленными методами, такими как тест Эймса, и является полезным инструментом для проверки генотоксичных соединений, которые могут оказаться канцерогенными для человека, с целью выделения химических веществ для дальнейшего углубленного анализа.[1][2]

Как и в случае других тестов бактериальной генотоксичности и мутагенности, соединения, требующие метаболической активации для активности, могут быть исследованы с добавлением экстракта микросомальной печени крысы S9.

Механизм

В SOS ответ играет центральную роль в реакции Кишечная палочка к генотоксическим соединениям, потому что он реагирует на широкий спектр химических агентов. Срабатывание этой системы может быть и использовалось как ранний признак повреждения ДНК. Два гена играют ключевую роль в ответе SOS: lexA кодирует репрессор для всех генов в системе, а recA кодирует белок, способный расщеплять репрессор LexA при активации сигналом, индуцирующим SOS (в данном случае вызванным присутствием генотоксическое соединение). Хотя точный механизм SOS-ответа все еще неизвестен, он индуцируется, когда повреждения ДНК нарушают или останавливают репликацию ДНК. .[3]

Различные конечные точки являются возможными индикаторами срабатывания системы SOS; активация белка RecA, расщепление репрессора LexA, экспрессия любого из генов SOS и т. д. Один из простейших анализов состоит в мониторинге экспрессии гена SOS посредством слияния с lacZ, структурным геном для Кишечная палочка β-галактозидаза.

Процедура

Обзор использования SOS-ответа для тестирования генотоксичности

Хромотест SOS состоит из инкубации Кишечная палочка при увеличении концентрации исследуемого химического вещества. После предоставления времени для синтеза белка активность β-галактозидазы анализируется с помощью простого колориметрического анализа. За счет включения аналога лактозы, который дает окрашенное соединение при разложении, легко наблюдаемое или поддающееся количественной оценке изменение цвета используется в качестве показателя. Поскольку тестируемое химическое вещество может подавлять синтез белка при более высоких концентрациях, что привело бы к недооценке индукции B-галактозидазы, щелочную фосфатазу анализируют одновременно с β-галактозидазой, чтобы масштабировать данные для выживаемости клеток.

Анализ можно легко завершить за несколько часов. При использовании считывающего устройства для микропланшетов тест является количественным, и кривые доза-ответ имеют начальную линейную область. Наклон этой линейной области позволяет однозначно связать каждое соединение с одним параметром, SOS-индуцирующей активностью (SOSIP), которая отражает индуцирующую активность соединения.[4]


Этот анализ обеспечивает как качественное (видимое наблюдение градиента цвета) для целей скрининга, так и количественное измерение (спектрофотометрия) для расчета общепринятых показателей. В количественном анализе строится график зависимости зависимости от дозы (цветность, связанная с производством бета-галактозидазы) соединения, причем наклон начальной линейной области используется в качестве универсального параметра, SOS-индуцирующей активности (SOSIP), которая отражает способность соединения вызывать SOS-ответ (измеряется косвенно через продукцию бета-галактозидазы и распад аналога лактозы). Обычно аналог лактозы представляет собой X-Gal, который дает синий цвет при расщеплении бета-галактозидазой. Дозовая реакция также масштабируется выживаемостью клеток, измеряемой по распаду щелочной фосфатазы (которая дает желтый цвет), что позволяет рассчитать SOSIP.

Хотя SOSIP является метрикой, основанной на концентрации, тот же метод может использоваться для сложных смесей окружающей среды, где концентрация или даже интересующие соединения неизвестны. Посредством расчета промежуточного фактора индукции SOS (SOSIF), который может быть нанесен на график в зависимости от разбавления таким же образом, чтобы дать иллюстрацию реакции на дозу без предварительных аналитических измерений образцов.

Преимущества

Хромотест SOS считается самым простым и быстрым краткосрочным тестом на генотоксичность. Он служит полезным и экономичным дополнением к традиционному тесту Эймса по ряду причин. Во-первых, из-за своей простоты и быстроты SOS-хромотест может использоваться в качестве скринингового теста на большое количество потенциально генотоксичных соединений. Во-вторых, это может позволить обнаруживать генотоксичные химические вещества, которые дают ложноотрицательные результаты в тесте Эймса (например, эстрадиол, соединение, вызывающее растущее беспокойство). В-третьих, это может оказаться эффективным методом распознавания ложноположительных результатов теста Эймса.

Рекомендации

  1. ^ Мон Г.Р. (сентябрь 1981 г.). «Бактериальные системы для тестирования канцерогенности». Мутат. Res. 87 (2): 191–210. Дои:10.1016/0165-1110(81)90032-4. PMID  6799816.
  2. ^ Купить IF (июль 1982 г.). «Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды. Рабочий документ ICPEMC 2/6. Оценка прогностических тестов на канцерогенность». Мутат. Res. 99 (1): 53–71. Дои:10.1016/0165-1110(82)90031-8. PMID  6811893.
  3. ^ Quillardet, Hofnung (1993). «Хромотест SOS: обзор». Мутационные исследования. 297 (3): 235–279. Дои:10.1016 / 0165-1110 (93) 90019-к. PMID  7692273.
  4. ^ Quillardet P, Huisman O, D'Ari R, Hofnung M (октябрь 1982 г.). «SOS-хромотест, прямой анализ индукции функции SOS в Escherichia coli K-12 для измерения генотоксичности». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 79 (19): 5971–5. Bibcode:1982PNAS ... 79.5971Q. Дои:10.1073 / пнас.79.19.5971. ЧВК  347033. PMID  6821127.