Секвенирование малых РНК - Small RNA sequencing - Wikipedia

Секвенирование малых РНК (Small-Seq) - это тип Секвенирование РНК на основе использования NGS технологии, которые позволяют изолировать и получать информацию о молекулах некодирующих РНК, чтобы оценивать и открывать новые формы малых РНК и прогнозировать их возможные функции. Используя этот метод, можно отличить малые РНК от более крупного семейства РНК, чтобы лучше понять их функции в клетке и в клетке. экспрессия гена. Small RNA-Seq может анализировать тысячи малых молекул РНК с высокой производительностью и специфичностью. Наибольшее преимущество использования RNA-seq заключается в возможности создания библиотек фрагментов РНК, исходя из всего содержимого РНК клетки.

Вступление

Малые РНК - это некодирующие молекулы РНК длиной от 20 до 200 нуклеотидов, которые содержатся в более крупном классе нкРНК. В частности, термин «малый» относится к бактериям, тогда как для эукариотических клеток используется более общий термин «нкРНК».[1]. Эти молекулы характеризуются наличием высокой плотности СТОП-кодоны и очень короткий Последовательности ORF: по этой причине они не участвуют в кодировании, но действуют как регуляторы экспрессии генов в клетке.

Описательная схема молекул РНК

Малые РНК включают несколько различных классов некодирующих РНК, в зависимости от их размеров и функций: мяРНК, snoRNA, скРНК, пиРНК, miRNA и миРНК. Их функции идут от РНКи (специфично для эндогенно экспрессируемой миРНК и экзогенно полученной миРНК), процессинг и модификация РНК, подавление гена (например, инактивация Х-хромосомы Xist РНК ), модификации эпигенетики модификации, стабильность и транспорт белков.

Малая РНК «неспособна индуцировать только РНКи, и для выполнения поставленной задачи она должна формировать ядро ​​РНК-белкового комплекса, называемого РНК-индуцированным комплексом подавления (RISC), особенно с белком аргонавта».[2]

Секвенирование малых РНК

Очищение

Этот шаг очень важен и важен для любого молекулярного метода, поскольку он гарантирует, что фрагменты малой РНК, обнаруженные в анализируемых образцах, будут характеризоваться хорошим уровнем чистоты и качества. В зависимости от целей эксперимента можно использовать разные методы очистки:

  • кислотная экстракция тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния: он основан на использовании раствора гуанидиния-тиоцианата в сочетании с кислым фенолом, который разрушает клеточные мембраны, выводя в раствор нуклеиновые кислоты и инактивируя клеточные рибонуклеазы (хаотропный агент ). После этого этапа добавляют аликвоту хлороформа, чтобы отделить водную фазу (содержащую молекулы РНК) от органической фазы (клеточный мусор и другие загрязнители).
  • спин-колоночная хроматография: универсально используемый метод очистки нуклеиновых кислот, который использует спин-колонку, содержащую специальную смолу, которая после первого этапа лизиса клеток позволяет связывать молекулы РНК, элюируя несвязанные частицы (несколько белков и рРНК ) [3]. Протокол включает два отдельных хроматографических прогона: первый требуется для выделения всего содержимого РНК из образца, а второй предназначен для выделения малой РНК путем добавления матрицы, обогащенной малой РНК, в колонку и с помощью специального буфер, чтобы окончательно их элюировать. Этот метод может разделять небольшие молекулы РНК без необходимости добавления фенола. [4].

После выделения малых РНК важно определить их количество и оценить качество очистки. Для этого есть два разных метода:

  • анализ оптической плотности и гель-электрофорез: этот практический подход основан на использовании спектрофотометра для оценки оптической плотности молекул РНК при 260 нм (1 OD = 40 мкг / мкл), чтобы оценить их концентрацию и обнаружить возможные загрязнения (например, белки или углеводы); это можно сочетать с проведением электрофоретического анализа в условиях денатурации (8 M мочевина) для анализа качества очищающих экстрактов (экстракты низкого качества будут разлагаться и отображаться в виде мазков в геле).
  • Биоанализатор Agilent: полностью автоматизированная технология, основанная на использовании специального аппарата, состоящего из микросхемы, позволяющего выполнять капиллярный электрофорез (КЭ) использование небольших аликвот исходных образцов и получение электрофореграммы, которая полезна для оценки качества экстрактов благодаря шкале (от 1 до 10), присвоенной системой.

Подготовка и расширение библиотеки

Многие протоколы секвенирования NGS полагаются на создание геномной библиотеки, содержащей тысячи фрагментов нуклеиновых кислот-мишеней, которые затем будут секвенированы с помощью соответствующих технологий. В зависимости от используемых методов секвенирования библиотеки могут создаваться по-разному (в случае Ион Торрент технология фрагменты РНК прикрепляются непосредственно к магнитной бусине через адаптер, а для Иллюмина При секвенировании фрагменты РНК сначала лигируют с адаптерами, а затем прикрепляют к поверхности планшета): как правило, универсальные адаптеры A и B (содержащие хорошо известные последовательности, включающие Уникальные молекулярные идентификаторы которые используются для количественного определения малых РНК в образце и индексирование образца что позволяет различать разные молекулы РНК, полученные из разных образцов) лигируются с 5 'и 3' концами фрагментов РНК благодаря активности Т4 РНК-лигаза 2 усеченных. После лигирования адаптеров к обоим концам малых РНК, ретротранскрипция происходит производство комплементарных молекул ДНК (кДНК ), которые, в конечном итоге, будут усилены различными методами амплификации в зависимости от протокола секвенирования, которому следуют (Ion Torrent использует эмульсионная ПЦР, в то время как Illumina требует мостик ПЦР ), чтобы получить до миллиардов ампликоны быть упорядоченным [5]. Помимо обычной смеси для ПЦР, добавляются маскирующие олигонуклеотиды, нацеленные на 5,8s рРНК, для повышения чувствительности к малым РНК-мишеням и для улучшения результатов амплификации. Следует проявлять осторожность, так как образцы РНК склонны к деградации, и дальнейшее совершенствование этого метода должно быть направлено на устранение димеров адаптера. [5].

Последовательность действий

В зависимости от цели анализа RNA-seq может выполняться с использованием разных подходов:

  • Секвенирование ионного торрента: технология NGS, основанная на использовании полупроводникового чипа, в который загружается образец, интегрирована с ионно-чувствительным полевым транзистором, способным чувствительно обнаруживать снижение значения pH из-за высвобождения одного или нескольких протонов после включение одного или нескольких dNTP во время секвенирования путем синтеза: затем сигнал передается в машину, состоящую из электронной считывающей платы - для взаимодействия с микросхемой -, микропроцессора - для обработки сигналов - и жидкостной системы - для управления поток реагентов по чипу [6].
  • Секвенирование Illumina: это хороший метод секвенирования малых РНК, и это наиболее широко используемый подход. [7]. После этапов подготовки библиотеки и амплификации секвенирование (на основе использования обратимые терминаторы красителя ) может выполняться с использованием различных систем, таких как Miseq System, Miseq Series, NextSeq Series и многих других, в зависимости от приложений. [8]

Анализ и хранение данных

Последний шаг касается анализа данных и хранения: после получения считываний секвенирования UMI и индексные последовательности автоматически удаляются из считываний, и их качество анализируется с помощью PHRED (программное обеспечение, позволяющее оценить качество процесса секвенирования); чтения затем можно сопоставить или сопоставить с эталонным геномом, чтобы извлечь информацию об их сходстве: чтения, имеющие одинаковую длину, последовательность и UMI, считаются равными и удаляются из списка совпадений. Действительно, количество различных UMI для данной последовательности малой РНК отражает количество ее копий. Наконец, малые РНК количественно оцениваются путем присвоения молекул аннотациям транскриптов из различных баз данных (Mirbase, GtRNAdb и Gencode). [5].

Приложения

Секвенирование малых РНК может быть полезно для:

  • изучение профиля экспрессии miRNA и других малых РНК
  • повышение понимания того, как клетки регулируются или неправильно регулируются в патологических условиях
  • кластеризация малых РНК
  • новое открытие малых РНК
  • предсказание малых РНК
  • дифференциальная экспрессия всех малых РНК в любом образце

Рекомендации

  1. ^ Сторц Г. (17 мая 2002 г.). «Расширяющаяся вселенная некодирующих РНК». Наука. 296(5571):1260-3. DOI: 10.1126 / science.1072249. PMID  12016301.
  2. ^ Роберт А. Мейерс (2012). Эпигенетическая регуляция и эпигеномика, стр. 366.
  3. ^ Citartan M, Tan SC, Tang TH. (2012 28 января). «Быстрый и экономичный метод очистки малых РНК». Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии. 28(1):105-11. DOI: 10.1007 / s11274-011-0797-0. PMID  22806785.
  4. ^ Дональд К. Рио, Мануэль Арес-младший, Грегори Дж. Хэннон и Тимоти В. Нильсен (2011). «РНК: лабораторное руководство». CSHL Press.
  5. ^ а б c Хагеманн-Йенсен М., Абдуллаев И., Сандберг Р., Фаридани О.Р. (октябрь 2018 г.). «Small-seq для секвенирования малой РНК одной клетки». Протоколы природы. 13(10):2407-2424. DOI: 10.1038 / s41596-018-0049-у. PMID  30250291.
  6. ^ Ротберг Дж. М., Хинц В., Реарик Т. М., Шульц Дж., Милески В., Дэйви М., Лимон Дж. Х., Джонсон К., Милгрю М. Дж., Эдвардс М., Хун Дж., Саймонс Дж. Ф., Марран Д., Майерс Дж. В., Дэвидсон Дж. Ф., Брантинг А., Нобиле Дж. Р. , Puc BP, Light D, Clark TA, Huber M, Branciforte JT, Stoner IB, Cawley SE, Lyons M, Fu Y, Homer N, Sedova M, Miao X, Reed B, Sabina J, Feierstein E, Schorn M, Alanjary М, Дималанта Е., Дрессман Д., Касинскас Р., Сокольский Т., Фиданза Дж. А., Намсараев Е., МакКернан К. Дж., Уильямс А., Рот GT, Бустилло Дж. (Июль 2011 г.). «Интегрированное полупроводниковое устройство, позволяющее неоптическое секвенирование генома». Природа. 475(7356):348-52. DOI: 10.1038 / природа.10242. PMID  21776081.
  7. ^ «Секвенирование малых РНК | Профилирование и открытие малых РНК и миРНК». www.illumina.com. Получено 2018-11-28.
  8. ^ Перепел М.А., Смит М., Коупленд П., Отто Т.Д., Харрис С.Р., Коннор Т.Р., Бертони А., Свердлоу Х.П., Гу Y (июль 2012 г.). «Рассказ о трех платформах секвенирования следующего поколения: сравнение секвенсоров Ion Torrent, Pacific Biosciences и Illumina MiSeq». BMC Genomics. 13:341. DOI: 10.1186 / 1471-2164-13-341. PMID  22827831.

Смотрите также

  • Барквист Л., Фогель Дж. (2015). «Ускорение открытия и функционального анализа малых РНК с помощью новых технологий». Ежегодный обзор генетики. 49:367-394. 10.1146 / annurev-genet-112414-054804. PMID  26473381.
  • Hrdlickova R, Toloue M, Tian B (январь 2017 г.). «Методы RNA-Seq для анализа транскриптомов». Интернет-библиотека Wiley. 8(1). 10.1002 / wrna.1364. PMID  27198714.
  • Фаридани О.Р., Абдуллаев И., Хагеманн-Йенсен М., Шелл Дж. П., Ланнер Ф., Сандберг Р. (2016 г., декабрь). «Одноклеточное секвенирование транскриптома малой РНК». Природа Биотехнологии. 34(12):1264-1266. 10.1038 / nbt.3701. PMID  27798564.
  • Озсолак Ф., Милош П.М. (февраль 2011 г.). «Секвенирование РНК: достижения, проблемы и возможности». Природа Обзоры Генетика. 12(2):87-98. 10.1038 / nrg2934. PMID  21191423.
  • Венециано Д., Ди Белла С., Нигита Дж., Лагана А., Ферро А., Кроче С. М. (2016 г., декабрь). «Некодирующая РНК: современные подходы к анализу данных глубокого секвенирования и проблемы». Интернет-библиотека Wiley. 37(12):1283-1298. 10.1002 / humu.23066. PMID  27516218.
  • Raabe CA, Tang TH, Brosius J, Рождественский Т.С. (февраль 2014 г.). «Ошибки в данных глубокого секвенирования малых РНК». Исследования нуклеиновых кислот. 42(3):1414-1426. 10.1093 / nar / gkt1021. PMID  24198247.
  • 't Hoen PA, Friedländer MR, Almlöf J, Sammeth M, Pulyakhina I., Anvar SY, Laros JF, Buermans HP, Karlberg O, Brännvall M; Консорциум GEUVADIS, den Dunnen JT, van Ommen GJ, Gut IG, Guigó R, Estivill X, Syvänen AC, Dermitzakis ET, Lappalainen T. (ноябрь 2013 г.). «Воспроизводимость высокопроизводительного секвенирования мРНК и малых РНК в лабораториях». Природа Биотехнологии. 31(11):1015-1022. 10.1038 / nbt.2702. PMID  24037425.
  • Байрон С.А., Ван Керен-Йенсен К.Р., Энгельталер Д.М., Карптен Д.Д., Крейг Д.В. (2016 г., май). «Перевод секвенирования РНК в клиническую диагностику: возможности и проблемы». Природа Обзоры Генетика. 17(5):257-271. 10.1038 / nrg.2016.10. PMID  26996076.
  • Цеслик М., Чиннайян А.М. (февраль 2018 г.). «Профилирование транскриптома рака на стыке клинического перевода». Природа Обзоры Генетика. 19(2):93-109. 10.1038 / nrg.2017.96. PMID  29279605.
  • Мартин Дж. А., Ван З. (сентябрь 2011 г.). «Сборка транскриптомов нового поколения». Природа Обзоры Генетика. 12(10):671-82. 10.1038 / nrg3068. PMID  21897427.