Иммуноферментный иммуноферментный анализ - Surround optical-fiber immunoassay - Wikipedia

Иммуноферментный анализ оптического волокна

Прототип иммуноанализа объемного оптического волокна
Акроним	СОФИЯ
Использует	Медицина, безопасность пищевых продуктов, промышленность, ветеринария
Известные эксперименты	Обнаружение прионы в моче и крови доклинических носителей
Изобретатель	Лос-Аламосская национальная лаборатория и SUNY
Модель	Прототип

Иммуноферментный иммуноферментный анализ (СОФИЯ) является сверхчувствительным, in vitro диагностическая платформа с окантовкой оптоволокно сборка, которая фиксирует флуоресценция выбросы от всего образца. Определяющими характеристиками технологии являются ее чрезвычайно высокая предел обнаружения, чувствительность, и динамический диапазон. Чувствительность SOFIA измеряется на аттограмма уровень (10⁻¹⁸ g), что делает его примерно в миллиард раз более чувствительным, чем традиционные методы диагностики. Благодаря расширенному динамическому диапазону SOFIA может различать уровни аналит в выборке более 10 порядки величины, способствуя точному титрование.

В качестве диагностической платформы SOFIA имеет широкий спектр приложений. Несколько исследований уже продемонстрировали беспрецедентную способность SOFIA обнаруживать встречающиеся в природе прионы в крови и моче носителей болезней.^[1][2][3] Ожидается, что это приведет к первому надежному предсмертный скрининговый тест на vCJD, BSE, скрепи, CWD, и другие трансмиссивные губчатые энцефалопатии.^[4] Учитывая чрезвычайную чувствительность технологии, ожидается появление дополнительных уникальных приложений, в том числе in vitro тесты на другие нейродегенеративные заболевания, такие как Болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.^[3]

SOFIA была разработана в результате совместного исследовательского проекта между Лос-Аламосская национальная лаборатория и Государственный университет Нью-Йорка, и был поддержан Министерства обороны Национальная программа исследования прионов.

Фон

Традиционный метод выполнения лазерно-индуцированной флуоресценции, а также другие виды спектроскопический измерения, такие как инфракрасный, ультрафиолетовая и видимая спектроскопия, фосфоресценция и т. д., заключается в использовании небольшого прозрачного лабораторного сосуда, кювета, чтобы содержать образец для анализа.^{[нужна цитата ]}

Для проведения измерения кювета заполняется исследуемой жидкостью, а затем освещается лазером, сфокусированным через одну из лицевых сторон кюветы. Линза размещается на одной из сторон кюветы, расположенной под углом 90 ° от входного окна, для сбора индуцированного лазером флуоресцентного света. Только небольшой объем кюветы фактически освещается лазером и дает детектируемое спектроскопическое излучение. Выходной сигнал значительно уменьшается, поскольку линза улавливает только около 10% спектроскопического излучения из-за соображений телесного угла. Этот метод используется не менее 75 лет; еще до появления лазера, когда для возбуждения флуоресценции использовались обычные источники света.^[5]

SOFIA решает проблему низкой эффективности улавливания, поскольку собирает почти весь флуоресцентный свет, производимый анализируемым образцом, увеличивая количество сигнала флуоресценции примерно в 10 раз по сравнению с обычным устройством.

Технологические преимущества

SOFIA - это устройство и метод улучшенной оптической геометрии для улучшения спектроскопического обнаружения аналиты в образце. Изобретение уже продемонстрировало свои функциональные возможности в качестве устройства и способа сверхчувствительного обнаружения прионы и других аналитов низкого уровня. SOFIA сочетает в себе специфичность, присущую моноклональные антитела для захвата антигена с чувствительностью технологии объемного оптического обнаружения. Для обнаружения чрезвычайно низкого уровня сигнала в качестве детектора системы используется малошумящий фотоэлектрический диод. SOFIA использует лазер для освещения микрокапиллярной трубки, содержащей образец. Затем свет, собранный от образца, направляется на переносную оптику от оптических волокон. Затем свет оптически фильтруется для обнаружения, которое выполняется как измерение тока, усиленное против шума с помощью синхронизированного усиления цифровой обработки сигнала. Результаты отображаются на компьютере и в программном обеспечении, предназначенном для сбора данных.^{[нужна цитата ]}

У такой детекторной матрицы множество преимуществ. Прежде всего, он позволяет оптимально исследовать очень маленькие образцы с низкой концентрацией с использованием метода лазерной флуоресценции. Эта система обнаружения на основе волокна может быть адаптирована к существующим короткоимпульсный оборудование для обнаружения, которое изначально было разработано для секвенирования отдельных молекул ДНК. Геометрия также подходит для использования в схемах обнаружения одиночных молекул с помощью лазера с короткими импульсами. Многопортовая геометрия системы позволяет эффективно обрабатывать электронные сигналы от каждого плеча устройства. Наконец, что, возможно, наиболее важно, волоконно-оптические кабели по существу на 100% эффективны в оптической передаче, имея затухание менее 10 дБ / км. Таким образом, после развертывания для использования на объекте информация о флуоресценции может быть передана оптоволоконным путем в удаленное место, где могут выполняться обработка и анализ данных.

Компоненты SOFIA

SOFIA содержит контейнер для образцов многолуночного планшета, автоматизированное средство для последовательной транспортировки образцов из контейнера для образцов многолуночного планшета в прозрачный капилляр, содержащийся в держателе образца, источник возбуждения, оптически связанный с образцом, при этом излучение от источника возбуждения направлено вдоль длина капилляра, в котором излучение индуцирует сигнал, который испускается из образца, и, по меньшей мере, один линейный массив.^{[нужна цитата ]}

Шаги в SOFIA

Подготовка к анализу

После амплификации и последующего концентрирования целевого аналита образцы метят флуоресцентным красителем с использованием антител для определения специфичности, а затем, наконец, загружают в микрокапиллярную трубку. Эта трубка помещена в специально сконструированное устройство, поэтому она полностью окружена оптическими волокнами, чтобы улавливать весь свет, излучаемый при возбуждении красителя лазером.^[6]

Рисунок 1: Схематическое изображение SOFIA

Инструментальная обработка

Это оборудование представляет собой спектроскопическое (светосборное) устройство и соответствующий метод для быстрого обнаружения и анализа аналитов в образце. Образец облучается источником возбуждения, оптически связанным с образцом. Источник возбуждения может включать в себя, помимо прочего, лазер, лампу-вспышку, дуговую лампу, светоизлучающий диод и т.п.

На рисунке 1 изображена текущая версия системы SOFIA. Четыре линейных массива (101) проходят от держателя образца (102), в котором находится удлиненный прозрачный контейнер для образца, открытый с обоих концов, до оконечного порта (103). Дистальный конец концевого порта (104) вставлен в узел концевого порта (200). Линейные матрицы (101) содержат множество оптических волокон, имеющих первый конец и второй конец, причем множество оптических волокон необязательно окружено защитной и / или изолирующей оболочкой. Оптические волокна расположены линейно, что означает, что они существенно копланарный относительно друг друга так, чтобы образовать вытянутый ряд волокон.

Приложения

Интересующий аналит может быть биологическим или химическим по природе и только в качестве примера может включать химические вещества. части (токсины, метаболиты, лекарства и остатки лекарств), пептиды, белки, клеточные компоненты, вирусы и их комбинации. Интересующий аналит может находиться либо в жидкости, либо в поддерживающей среде, такой как гель.

SOFIA продемонстрировала свой потенциал как устройство с широким спектром приложений. К ним относятся клинические применения, такие как обнаружение заболеваний, выявление предрасположенности к патологиям, постановка диагноза и отслеживание эффективности назначенных методов лечения, а также доклинические применения, такие как предотвращение попадания токсинов и других патогенных агентов в продукты, предназначенные для потребления человеком:

• Клинические применения - SOFIA может использоваться для проведения как качественных тестов (положительных или отрицательных результатов) для обнаружения или идентификации бактерий или вирусов, так и количественных тестов (измерение веществ) для обнаружения или количественной оценки биологических констант или маркеров, которые являются веществами, вырабатываемыми организмом. при наличии, например, инфекционного заболевания (чтобы можно было определить вирусную нагрузку, например, при терапии СПИДа, или уровень токсичности при обнаружении злоупотребления лекарственными средствами).
• Доклинические применения - В качестве иммуноанализа SOFIA потенциально может использоваться в более широком масштабе для мониторинга качества пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, косметики или воды, а также общих параметров окружающей среды и сельскохозяйственных продуктов. Возможность выявлять и проверять бактерии и токсины для широкого спектра продуктов является растущим и более сложным требованием, о чем может свидетельствовать рост заболеваемости болезнями пищевого происхождения и животными, такими как Кишечная палочка, сальмонелла, BSE, птичий грипп и др.

Ante mortem тест на прионные заболевания

SOFIA использовалась для быстрого обнаружения аномальной формы прионного белка (ПрП^Sc ) в образцах биологических жидкостей, таких как кровь или моча. ПрП^Sc белок-маркер, используемый в диагностике трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE), примеры которых включают губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота (например, «коровье бешенство»), скрепи у овец, и Болезнь Крейтцфельдта-Якоба в людях. В настоящее время не существует быстрых средств для предсмертный обнаружение PrP^Sc в разбавленных количествах, в которых он обычно появляется в жидкостях организма. SOFIA имеет преимущества, заключающиеся в том, что для подготовки образцов требуется небольшая подготовка, а также возможность размещения электронного диагностического оборудования за пределами зоны содержания.

Фон

TSE, или прионные заболевания, представляют собой инфекционные нейродегенеративные заболевания млекопитающих, которые включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническая истощающая болезнь оленей и лосей, скрейпи у овец и болезнь Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ) у людей. TSE могут передаваться от хозяина к хозяину при проглатывании инфицированных тканей или переливании крови. Клинические симптомы TSE включают потерю движений и координации и деменцию у людей. У них инкубационные периоды от месяцев до лет, но после появления клинических признаков они быстро прогрессируют, не поддаются лечению и неизменно приводят к летальному исходу. Попытки снизить риск TSE привели к значительным изменениям в производстве и торговле сельскохозяйственными товарами, лекарствами, косметикой, донорством крови и тканей, а также продуктами биотехнологии. Посмертное нейропатологическое исследование ткани головного мозга животного или человека остается «золотым стандартом» диагностики TSE и является очень специфичным, но не таким чувствительным, как другие методы.^[7]

Для повышения безопасности пищевых продуктов было бы полезно проверять всех животных на прионные болезни, используя предсмертныйдоклиническое тестирование, то есть тестирование до появления симптомов. Однако PrP^Sc уровни очень низкие у бессимптомных хозяев. Кроме того, ПрП^Scs, как правило, неравномерно распределяются в тканях организма, при этом самые высокие концентрации постоянно обнаруживаются в тканях нервной системы, а очень низкие - в легко доступных жидкостях организма, таких как кровь или моча. Следовательно, любой такой тест может потребоваться для обнаружения чрезвычайно малых количеств PrP и должен дифференцировать PrP^C и ПрП^Sc.

Текущий ПрП^Sc методы обнаружения требуют много времени и требуют вскрытие анализ после того, как у подозрительных животных проявятся один или несколько симптомов заболевания. Современные методы диагностики основаны в основном на обнаружении физико-химических различий между PrP.^C и ПрП^Sc которые на сегодняшний день являются единственными надежными маркерами TSE. Например, наиболее широко используемые диагностические тесты используют относительную протеаза сопротивление PrP^Sc в образцах мозга, чтобы различать PrP^C и ПрП^Sc, в сочетании с обнаружением антител ПК -устойчивая часть ПрП^Sc. Пока не удалось обнаружить прионные заболевания с помощью обычных методов, таких как полимеразная цепная реакция, серология или анализы на культуре клеток. Агент-специфическая нуклеиновая кислота еще не идентифицирована, и инфицированный хозяин не вызывает ответа антител.

Конформационно измененная форма PrP^C это PrP^Sc. Некоторые группы считают, что PrP^Sc является инфекционным агентом (прионным агентом) в TSE, в то время как другие группы этого не делают. ПрП^Sc может быть невропатологический продукт болезненного процесса, компонент инфекционного агента, сам инфекционный агент или что-то еще. Независимо от того, какова его действительная функция при заболевании, PrP^Sc явно специфически связан с болезненным процессом, и его обнаружение указывает на инфицирование агентом, вызывающим прионные заболевания.

СОФИЯ как предсмертный тест на прионные заболевания

Помимо прочего, SOFIA предлагает методы диагностики прионных заболеваний путем обнаружения PrP.^Sc в биологическом образце. Этим биологическим образцом может быть ткань мозга, нервная ткань, кровь, моча, лимфатическая жидкость, спинномозговая жидкость, или их комбинация. Отсутствие ПрП^Sc указывает на отсутствие инфекции инфекционным агентом до пределов обнаружения методов. Обнаружение присутствия PrP^Sc указывает на инфицирование инфекционным агентом, связанным с прионной болезнью. Заражение прионным агентом может быть обнаружено как на пресимптоматической, так и на симптоматической стадиях прогрессирования заболевания.

Эти и другие улучшения были достигнуты с помощью SOFIA.^[3] Чувствительность и специфичность SOFIA устраняют необходимость в PK-расщеплении, чтобы различать нормальные и аномальные изоформы PrP. Дальнейшее обнаружение PrP^Sc в плазма крови теперь решается ограниченным PMCA за ней следует СОФИЯ. Из-за чувствительности SOFIA циклы PMCA могут быть сокращены, что снижает вероятность спонтанного PrP.^Sc формирование и обнаружение ложноположительных образцов.SOFIA удовлетворяет потребности в повышенной чувствительности выявления прионных заболеваний как у пресимптоматических, так и у симптоматических TSE-инфицированных животных, включая людей, путем предоставления методов анализа с использованием высокочувствительных инструментов, которые требуют меньше подготовки образцов чем ранее описанные методы, в комбинации с недавно разработанными Mab против PrP. Метод данной версии SOFIA обеспечивает уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP.^Sc в мозговой ткани. В сочетании с ограниченным sPMCA способы по настоящему изобретению обеспечивают уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP^Sc в плазме крови, тканях и других жидкостях, собранных прижизненно^{[нужна цитата ]}.

Методы сочетают в себе специфику Mab для антиген захват и концентрация с чувствительностью технологии обнаружения объемного оптического волокна. В отличие от ранее описанных методов обнаружения PrP^Sc в мозгу гомогенаты эти методы, когда они используются для изучения гомогенатов мозга, не используют затравочную полимеризацию, амплификацию или ферментативное расщепление (например, протеиназой K или PK). Это важно, поскольку в предыдущих отчетах указывалось на существование PrP.^Sc изоформы с различной чувствительностью PK, что снижает надежность анализа. Чувствительность этого анализа делает его подходящим в качестве платформы для быстрого определения прионов в биологических жидкостях. В дополнение к прионным заболеваниям этот метод может предоставить средства для быстрого и высокопроизводительного тестирования широкого спектра инфекций и расстройств.

Хотя около 40 циклов sPMCA в сочетании с иммунопреципитацией оказались неадекватными для PrP^Sc обнаружение в плазме с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, PrP^Sc также было обнаружено, что его легко измерить методами SOFIA. Ограниченное количество циклов, необходимое для данной платформы анализа, практически исключает возможность получения ложноположительных результатов, связанных с PMCA, таких как ранее сообщенные (Thorne and Terry, 2008).^[8]

Другие клинические применения

Благодаря быстрому развитию в области исследования биомаркеров многие инфекции и расстройства, которые невозможно диагностировать с помощью in vitro тестирование, становятся все более возможными. Предполагается, что SOFIA будет более широко использоваться при разработке диагностических тестов для инфекций и расстройств, выходящих за рамки прионных болезней.^[3] Основное потенциальное применение - при других заболеваниях неправильной укладки белка, в частности, болезни Альцгеймера.^[7]

Опубликованное исследование

В исследовании 2011 года сообщалось об обнаружении прионов в моче от естественно и орально инфицированных овец клиническим возбудителем скрейпи и орально инфицированных доклинических и инфицированных белохвостых оленей с клинической хронической болезнью истощения. Это первый отчет об обнаружении прионов PrP.^Sc из мочи овец или цервид с естественными или доклиническими заболеваниями прионами.^[1]

Исследование 2010 года продемонстрировало, что умеренное количество циклической амплификации с неправильным сворачиванием белков (PMCA) в сочетании с новой схемой обнаружения SOFIA может быть использовано для обнаружения PrP^Sc в плазме, не обработанной протеазой, от доклинических и клинических случаев скрепи овец и белохвостых оленей с хронической истощающей болезнью после естественного и экспериментального инфицирования. Связанная с заболеванием форма прионного белка (PrP^Sc), возникающий в результате конформационного изменения нормальной (клеточной) формы прионного белка (PrP^C), считается центральным в нейропатогенезе и служит единственным надежным молекулярным маркером для диагностики прионных заболеваний. Хотя самые высокие уровни PrP^Sc присутствуют в ЦНС, разработка разумного диагностического теста требует использования биологических жидкостей, которые обычно содержат чрезвычайно низкие уровни PrP^Sc. ПрП^Sc обнаружен в крови больных животных с помощью технологии PMCA. Однако, как сообщается, повторное переключение в течение нескольких дней, необходимое для PMCA материала крови, приводит к снижению специфичности (ложноположительные результаты). Для создания анализа на PrP^Sc в крови, которая является одновременно высокочувствительной и специфической, исследователи использовали ограниченный серийный PMCA (sPMCA) с SOFIA. Они не обнаружили никакого усиления sPMCA с добавлением полиадениловой кислоты, и не было необходимости сопоставлять генотипы PrP.^C и ПрП^Sc источники для эффективного усиления.^[2]

Исследование 2009 года показало, что SOFIA в ее нынешнем формате способна обнаруживать менее 10 аттограмм (г) рекомбинантного PrP хомяков, овец и оленей. Около 10 мкг ПрП^Sc из 263K-инфицированного мозга хомяка можно обнаружить с аналогичными нижними пределами PrP^Sc обнаружение из мозга овец, инфицированных скрепи, и оленей, инфицированных хронической болезнью истощения. Эти пределы обнаружения позволяют развести обработанный протеазой и необработанный материал сверх точки, в которой PrP^C, неспецифические белки или другой посторонний материал могут мешать PrP^Sc обнаружение сигнала и / или специфичность. Это не только снимает проблему специфичности PrP.^Sc обнаружения, но также увеличивает чувствительность, так как возможность частичного PrP^Sc протеолиз больше не вызывает беспокойства. SOFIA, вероятно, приведет к раннему предсмертный обнаружение трансмиссивных энцефалопатий, а также может использоваться с дополнительными протоколами целевой амплификации. SOFIA представляет собой чувствительное средство для обнаружения специфических белков, участвующих в патогенезе и / или диагностике заболевания, которое выходит за рамки трансмиссивных губчатых энцефалопатий.^[3]

Смотрите также

• Иммуноанализ

Рекомендации

1. Rubenstein, R .; и другие. (Сентябрь 2011 г.). «Обнаружение прионной болезни, кинетика PMCA и IgG в моче овец, естественно / экспериментально зараженных скрейпи, и оленей с доклинической / клинической хронической болезнью истощения». Журнал вирусологии. 85 (17): 9031–9038. Дои:10.1128 / jvi.05111-11. ЧВК  3165845. PMID  21715495.
2. Rubenstein, R .; и другие. (2010). "Иммуноферментный анализ оптического волокна Prion Surround (SOFIA): сверхчувствительный анализ для обнаружения PrP". Журнал общей вирусологии. 91 (Pt 7): 1883–1892. Дои:10.1099 / vir.0.020164-0. PMID  20357038.
3. Chang, B .; и другие. (2009). «Иммуноанализ оптического волокна Prion Surround (SOFIA): сверхчувствительный анализ для обнаружения PrP». Журнал вирусологических методов. 159 (1): 15–22. Дои:10.1016 / j.jviromet.2009.02.019. PMID  19442839.
4. «Национальная программа исследования прионов» (PDF). CDMRP, Министерство обороны. Получено 2012-02-27.
5. «ВОЛОКНО-ОПТИЧЕСКАЯ БЛОК ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ». Заявка на патент США 20110042585. Получено 2011-08-19.
6. «Обнаружение прионов в крови» (PDF). Микробиология сегодня.: 195. Август 2010. Архивировано с оригинал (PDF) 31 марта 2012 г.. Получено 2011-08-21.
7. "Иммуноанализ объемного оптического волокна (SOFIA)" (PDF). Лос-Аламосская национальная лаборатория. Получено 2011-08-19.
8. Брейтуэйт, С. (2010). «Оптимизация, адаптация и применение циклической амплификации с неправильным сворачиванием белков для обнаружения прионов в плазме крови» (PDF). Департамент биологических наук Университета Альберты. Получено 2012-02-27.

внешняя ссылка

• Бионоз
• SOFIA Видео Введение