Апоптотическая фрагментация ДНК - Apoptotic DNA fragmentation - Wikipedia

Белые полосы ДНК на темно-сером фоне, напоминающие ступеньки лестницы
Апоптотическая фрагментация ДНК, визуализированная Лестница ДНК проба (слева). А 1 кб маркер (в центре) и контроль ДНК (справа) включены для сравнения.

Апоптотическая фрагментация ДНК это ключевая особенность апоптоз, тип запрограммированная гибель клеток. Апоптоз характеризуется активацией эндогенного эндонуклеазы, особенно ДНКаза, активированная каспазой-3 (CAD),[1] с последующим расщеплением ядерной ДНК на межнуклеосомный фрагменты примерно 180 пар оснований (п.н.) и их кратные (360, 540 и т. д.). Апоптотическая фрагментация ДНК используется в качестве маркера апоптоза и для идентификации апоптотических клеток либо через Лестница ДНК проба[2] то TUNEL анализ,[3][4] или путем обнаружения клеток с фракционным содержанием ДНК («sub G1 клеток ") на гистограммах частоты содержания ДНК, например, как в Николетти пробирный.[5][6]

Механизм

Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, - это Cаспаза-Аактивирован DNase (CAD). CAD обычно подавляется другим белком, яингибитор Caspase Аактивирован DNase (ICAD). Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза-3, расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD.[7]

Двойная цепь ДНК, обернутая вокруг ядра гистоновых белков.
А нуклеосома, состоящий из ДНК (серый), обернутой вокруг гистон тетрамер (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в межнуклеосомный линкер область, входящая в состав ДНК нет обернутые вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК на межнуклеосомный линкер сайты между нуклеосомы, белковые структуры, которые встречаются в хроматин с интервалом ~ 180 п.н. Это потому, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистоны, основные белки нуклеосом. Сайты линкера - единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны CAD.

Распад ядерной ДНК на нуклеосомные единицы - один из признаков апоптотической гибели клетки. Это происходит в ответ на различные стимулы апоптоза в самых разных типах клеток. Молекулярная характеристика этого процесса позволила идентифицировать специфическую ДНКазу (CAD, ДНКазу, активируемую каспазой), которая расщепляет хромосомную ДНК каспазозависимым образом. CAD синтезируется с помощью ICAD (ингибитор CAD), который работает как специфический сопровождающий для CAD и обнаруживается в комплексе с ICAD в пролиферирующих клетках. Когда клетки подвергаются апоптозу, каспаза 3 расщепляет ICAD для диссоциации комплекса CAD: ICAD, позволяя CAD расщеплять хромосомную ДНК. Таким образом, клетки, у которых отсутствует ICAD или которые экспрессируют устойчивый к каспазам мутантный ICAD, не обнаруживают фрагментацию ДНК во время апоптоза, хотя они действительно проявляют некоторые другие признаки апоптоза и погибают.

Несмотря на то, что большая работа была проделана по анализу апоптотических событий, мало информации доступно для связи времени морфологических особенностей на поверхности клетки и в ядре с биохимической деградацией ДНК в одних и тех же клетках. Апоптоз может быть инициирован множеством различных механизмов в разных типах клеток, и кинетика этих событий широко варьируется, от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от клеточной системы. Наличие или отсутствие определенного апоптотического события (событий), включая фрагментацию ДНК, зависит от «временного окна», в котором исследуется кинетический процесс апоптоза. Часто это может затруднить идентификацию апоптозных клеток, если популяции клеток анализируются только в один момент времени, например. после индукции апоптоза.

Историческое прошлое

Открытие межнуклеосомной фрагментации геномной ДНК до регулярных повторяющихся олигонуклеосомных фрагментов, генерируемых Ca / Mg-зависимой эндонуклеазой, принято как один из наиболее хорошо охарактеризованных биохимических маркеров апоптоз (запрограммированная гибель клеток).

В 1970 г. Уильямсон описали, что цитоплазматическая ДНК, выделенная из клеток печени мыши после культивирования, характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярной массой, кратной 135 кДа. Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК были специфическим продуктом деградации ядерной ДНК.[8] В 1972 г. Керр, Вилли, и Карри ввел термин апоптоз и отличил этот тип гибели клеток от некроза на основании морфологических особенностей.[9] В 1973 г. Хьюиш и Burgoyne, при изучении структуры субхроматина, обнаружили, что хроматин доступен для Ca++/ Мг++ эндонуклеазой, в результате чего образуется продукт переваривания с регулярным рядом молекулярных масс, подобным тому, который был ранее описан Williamson (1970).[10] В 1974 г. Уильямс, Маленький, и Шиплис использованием клеток, подвергшихся различным типам травм, обнаружил, что во время гибели клетки деградированная ДНК «в каждом случае имела модальное значение от 10 (x6) до 10 (x7) дальтон, и клеточный метаболизм необходим для разрушения ДНК» . Однако это наблюдение не указывало на то, «была ли атака с разрезом на молекулу ДНК случайной или, скорее, на конкретном участке, имеющем структурное или функциональное значение».[11] В 1976 г. Скалка, Матясова, и Цейкова описана межнуклеосомная фрагментация ДНК облученного лимфоидного хроматина in vivo.[12]

Прошло шесть лет с 1972 по 1978/1980 годы до открытия и оценки межнуклеосомной фрагментации ДНК во время апоптотической гибели клеток как признака апоптоза. С 1972 г. (Керр, Вилли, и Карри[9]), считается, что гибель лимфоцитов, вызванная глюкокортикоидами, является формой апоптоза. В 1978 г. Захарян и Погосян представили документ, показывающий, что индуцированная глюкокортикоидами деградация ДНК в лимфоидной ткани, тимусе и селезенке крыс происходила по определенному паттерну с образованием фрагментов ДНК, которые были электрофоретически подобны тем, которые наблюдались после обработки хроматина микрококковой нуклеазой, что указывает на межнуклеосомный паттерн расщепления ДНК деградация произошла во время апоптоза.[13][14] Таким образом, была обнаружена первая связь между запрограммированной гибелью клеток / апоптозом и межнуклеосомной фрагментацией ДНК хроматина, которая вскоре стала характерным признаком апоптоза.

В 1980 г. Вилли сообщили о дополнительных доказательствах паттерна межнуклеосомного расщепления ДНК как специфической особенности обработанных глюкокортикоидами тимоцитов, подвергающихся апоптозу.[2] Модель межнуклеосомного расщепления ДНК наблюдалась как специфическая особенность апоптоза в 1978/1980 годах и с тех пор стала признанным признаком запрограммированной гибели клеток. В 1992 году Gorczyca et al. [3] и Гавриэли и др.[4] независимо описал Фрагментация ДНК анализ, основанный на использовании терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТУНЕЛЬ ), которые стали одним из стандартных методов обнаружения и идентификации апоптотических клеток.

Анализы обнаружения

Проточной цитометрии наиболее часто используется для обнаружения апоптотической фрагментации ДНК. Анализ содержания ДНК с помощью проточной цитометрии может идентифицировать апоптотические клетки с фрагментированной ДНК как клетки с фракционным содержанием ДНК, часто называемые суб-G1 клетки. Проточно-цитометрический анализ с использованием флуорохрома акридиновый апельсин показывает, что фрагментация ДНК внутри отдельных клеток является прерывистой, вероятно, отражая разные уровни ограничения доступа ДНК к ДНКазе наднуклеосомным и нуклеосомным уровнями структуры хроматина.[15] Наличие апоптотического суб-G1клетки »также можно обнаружить в клетках, предварительно закрепленных в этиловый спирт но не после фиксации в сшивающих фиксаторах, таких как формальдегид. Поздние S и G2 Апоптотические клетки не могут быть обнаружены с помощью этого подхода, потому что их фракционное содержание ДНК может перекрываться с содержанием неапоптотических G1 клетки.[16]Обработка клеток детергентом, предшествующим или одновременно с ДНК-флуорохромом, также выявляет фрагментацию ДНК в силу наличия суб-G1 клетки или клеточные фрагменты, как определено Nicoletti et al.[5]

Апоптотическая фрагментация ДНК также может быть обнаружена с помощью TUNEL анализ. Анализ TUNEL на основе флуорохромов, применимый для проточной цитометрии, коррелирует обнаружение разрывов цепи ДНК с содержанием клеточной ДНК и, следовательно, с клеточный цикл -фазовое положение. Тест TUNEL для мечения авидин-пероксидазой применим для светопоглощающей микроскопии. Многие комплекты, относящиеся к TUNEL, коммерчески доступны. Апоптотическая фрагментация ДНК также анализируется с использованием агароза гель электрофорез продемонстрировать "лестничный" рисунок с интервалами ~ 180 BP.[1] Некроз, с другой стороны, обычно характеризуется случайной фрагментацией ДНК, которая образует «мазок» на агарозных гелях.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Сакахира, H; Энари, М; Нагата, С. (январь 1998 г.). «Расщепление ингибитора CAD при активации CAD и деградации ДНК во время апоптоза». Природа. 391: 96–9. Дои:10.1038/34214. PMID  9422513.
  2. ^ а б Вилли А.Х. (1980-04-10). «Индуцированный глюкокортикоидами апоптоз тимоцитов связан с активацией эндогенных эндонуклеаз». Природа. 284 (5756): 555–556. Дои:10.1038 / 284555a0. ISSN  0028-0836. PMID  6245367.
  3. ^ Горчица, Вт; Бруно, S; Darzynkiewicz, R; Гонг, Дж; Darzynkiewicz, Z (ноябрь 1992 г.). «Разрывы цепи ДНК, происходящие во время апоптоза - их раннее обнаружение in situ с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и ник-трансляции и предотвращение с помощью ингибиторов сериновой протеазы». Int J Oncol. 1 (6): 639–48. PMID  21584593.
  4. ^ Гавриэли, Ю .; Sherman, Y .; Бен-Сассон, С. А. (1992). «Идентификация запрограммированной гибели клеток in situ с помощью специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК». Журнал клеточной биологии. 119 (3): 493–501. Дои:10.1083 / jcb.119.3.493. ЧВК  2289665. PMID  1400587.
  5. ^ Николетти I, Миглиорати Дж., Пальячи М.С., Гриньяни Ф., Риккарди С. (3 июня 1991 г.). «Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Журнал иммунологических методов. 139 (2): 271–279. Дои:10.1016 / 0022-1759 (91) 90198-О. PMID  1710634.
  6. ^ Риккарди С., Николетти И. (9 ноября 2006 г.). «Анализ апоптоза окрашиванием пропидиум йодидом и проточной цитометрией». Протоколы природы. 1 (3): 1458–1461. Дои:10.1038 / nprot.2006.238. PMID  17406435.
  7. ^ Nagata, S .; Enari, M .; Sakahira, H .; Yokoyama, H .; Okawa, K .; Ивамацу, А. (1998). «Активированная каспазой ДНКаза, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Природа. 391 (6662): 43–50. Дои:10.1038/34112. PMID  9422506.
  8. ^ Уильямсон, Роберт (1970-07-14). «Свойства быстро меченных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур клеток печени эмбриональных мышей». Журнал молекулярной биологии. 51 (1): 157–168. Дои:10.1016/0022-2836(70)90277-9. ISSN  0022-2836. PMID  5481278.
  9. ^ а б Керр, Джон Ф. Р .; Вилли, Эндрю; Карри, Аластер (август 1972 г.). «Апоптоз: основной биологический феномен с широким спектром влияния на кинетику тканей». Британский журнал рака. 26 (4): 239–257. Дои:10.1038 / bjc.1972.33. ISSN  0007-0920. ЧВК  2008650. PMID  4561027.
  10. ^ Burgoyne, Leigh A .; Бургойн, Ли А. (1973-05-15). «Субструктура хроматина. Расщепление ДНК хроматина на регулярно расположенных сайтах ядерной дезоксирибонуклеазой». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 52 (2): 504–510. Дои:10.1016 / 0006-291X (73) 90740-7. ISSN  0006-291X. PMID  4711166.
  11. ^ Уильямс, Джерри Р .; Литтл, Джон Б.; Шипли, Уильям У. (1974-12-20). «Ассоциация гибели клеток млекопитающих со специфической эндонуклеолитической деградацией ДНК». Природа. 252 (5485): 754–755. Дои:10.1038 / 252754a0. ISSN  0028-0836. PMID  4474604.
  12. ^ Ческова, М .; Matyásová, J; Цейкова, М. (1976-12-31). «ДНК в хроматине облученных лимфоидных тканей деградирует in vivo на регулярные фрагменты ». Письма FEBS. 72 (2): 271–274. Дои:10.1016/0014-5793(76)80984-2. ISSN  0014-5793. PMID  16386038.
  13. ^ Захарян, Р. А .; Погосян, Р. Г. (1978). "Глюкокортикоидная индукция деградации ДНК хроматина лимфоцитов на регулярно повторяющиеся фрагменты. in vivo". Доклады Академии Наук Армянской ССР. 67 (2): 110–114. ISSN  0366-8606. КОДЕКС: DANAAW, CAN 90: 115643 AN 1979: 115643 CAPLUS (Copyright 2003 ACS)
  14. ^ Chemical Abstracts v.90,1979; 90: 115643n p.112.
  15. ^ Кайстура, М; Галика, HD; Прижма, Дж; Darzynkiewicz, Z (2007). «Прерывистая фрагментация ядерной ДНК во время апоптоза, обнаруживаемая отдельными пиками« суб-G1 »на гистограммах содержания ДНК». Цитометрия А. 71: 125–31. Дои:10.1002 / cyto.a.20357. PMID  17252584.
  16. ^ Wlodkowic, D; Телфорд, Вт; Скоммер, Дж; Darzynkiewicz, Z (2011). «Апоптоз и не только: цитометрия в исследованиях запрограммированной гибели клеток». Методы Cell Biol. 103: 55–98. Дои:10.1016 / B978-0-12-385493-3.00004-8. ЧВК  3263828. PMID  21722800.

дальнейшее чтение

  • Corcoran, G .; Fix, L .; Jones, D.P .; Мослен, М. Т .; Nicotera, P .; Оберхаммер, Ф. А .; Буттян Р. (1994). «Апоптоз: молекулярная контрольная точка токсичности». Токсикология и прикладная фармакология. 128 (2): 169–181. Дои:10.1006 / taap.1994.1195. PMID  7940532.
  • Уокер, П. Р.; Pandey, S .; Сикорска, М. (1995). «Деградация хроматина в апоптотических клетках». Гибель клеток и дифференциация. 2 (2): 97–104. PMID  17180071.
  • Уокер, П. Р.; Сикорска, М. (1994). «Эндонуклеазная активность, структура хроматина и деградация ДНК при апоптозе». Биохимия и клеточная биология. 72 (11–12): 615–623. Дои:10.1139 / o94-081. PMID  7654335.
  • Pandey, S .; Уокер, П. Р.; Сикорска, М. (1994). «Отдельные пулы эндонуклеазной активности ответственны за межнуклеосомную и высокомолекулярную фрагментацию ДНК во время апоптоза». Биохимия и клеточная биология. 72 (11–12): 625–629. Дои:10.1139 / o94-082. PMID  7654336.
  • Muñoz, E .; Marcos, A .; Унзага, М. Т. (1981). «Влияние дефицита белка на активность лизосомальных ферментов селезенки и тимуса крыс-отъемышей». Журнал питания. 111 (12): 2133–2141. Дои:10.1093 / jn / 111.12.2133. PMID  7310538.
  • Варела П., Маркос А., Рей де Виньяс Дж. Л. (1985). «Эффект лечения кортизолом у беременных крыс на рост клеток потомства». IRCS Медицинская наука. 13: 412–413.