Флуоресцентные датчики хлорида - Fluorescent chloride sensors

Флуоресцентные датчики хлорида используются для химический анализ. Открытия хлористый (Cl⁻) участие в физиологических процессах стимулирует измерения внутриклеточного Cl⁻ в живых клетках и разработка флуоресцентных инструментов, о которых говорится ниже.

Красители на основе хинолина

хинолиний - на основе Cl⁻ индикаторы основаны на способности галогениды погасить флуоресценция гетероциклических органических соединений с четвертичным азот.^[1] Гашение флуоресценции происходит за счет механизма столкновения с линейным Отношения Стерна-Фольмера:

${\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}=1+K([Cl^{-}])}$

куда:
${\displaystyle F_{0}}$ флуоресценция в отсутствие галогенида
${\displaystyle F}$ флуоресценция в присутствии галогенида
${\displaystyle K}$ - константа закалки Штерна – Фольмера, которая зависит от концентрации хлорида, ${\displaystyle [Cl^{-}]}$. линейным образом.

Таким образом, индикаторы на основе хинолина представляют собой красители с одной длиной волны - сигнал возникает в результате мониторинга флуоресценции на одной длине волны. Ратиометрическое измерение концентрации галогенидов невозможно с хинолиниевыми красителями. Кинетика тушения столкновений ограничена только диффузией, и эти индикаторы обеспечивают субмиллисекундное временное разрешение. Красители на основе хинолиния нечувствительны к физиологическим изменениям pH, но они склонны к сильному отбеливание и требовать ультрафиолетовый возбуждение, вредное для живых организмов. Поскольку хинолиний не встречается в клетках естественным образом, необходима загрузка клеток. Однако красители на основе хинолиния плохо удерживаются в клетке и не могут быть легко нацелены на субклеточные органеллы. Кроме того, они не могут быть разработаны специально для определенного типа ячейки.

Наиболее часто используемый Cl на основе хинолиния⁻ индикаторами являются 6-метокси-1- (3-сульфонатопропил) хинолиний (SPQ), 6-метокси-N-этилхинолий Cl⁻ (MEQ) и N- (6-метоксихинолил) ацетоэтиловый эфир (MQAE).

YFP на основе Cl⁻ датчики

Cl⁻индикаторы могут быть разработаны на основе эндогенно экспрессируемых флуоресцентных белков, таких как Желтый флуоресцентный белок (YFP). Преимущество эндогенно экспрессируемых зондов перед зондами на основе красителей заключается в их способности достигать специфичности клеточного типа путем выбора Promoter_ (генетика) промотор. Индикаторы на основе YFP ​​представляют собой мутированные формы Зеленый флуоресцентный белок (GFP). YFP содержит четыре точечные мутации и имеет красный смещенный спектр возбуждения и излучения по сравнению с GFP. Флуоресценция YFP чувствительна к различным малым анионы с относительными потенциями йод > нитрат > хлористый > бромид > форматировать > ацетат.^[2] Чувствительность YFP к этим малым анионы возникает в результате связывания в основном состоянии вблизи хромофор,^[3] что явно меняет хромофор ионизация постоянным и, следовательно, флуоресцентным излучением. Флуоресценция YFP чувствительна к [Cl⁻ ] и pH. Эффект полностью обратимый.

YFP возбуждается в видимом диапазоне и является генетически кодируемым зондом. YFP на основе Cl⁻ сенсоры имеют относительно низкую кинетику Cl⁻ ассоциация / диссоциация. Константы полупериода ассоциации / диссоциации для мутанта YFP варьируются от 50 мс (YFP-H148Q I152L) до 2 секунд (YFP-H148Q V163S). Если флуоресцентные индикаторы основаны только на одном флуоресцентном белке, это не позволяет проводить логометрические измерения. Следовательно, обоснование результатов для ратиометрических флуоресцентных индикаторов.

Генетически кодируемый Cl на основе FRET⁻ индикаторы

Фёрстеровский резонансный перенос энергии Индикаторы Cl на основе (FRET) состоят из двух флуоресцентных белков, Голубой флуоресцентный белок (CFP) и YFP, подключенные через полипептид компоновщик. Это позволяет ратиометрическому Cl⁻ измерения на основе Cl⁻ чувствительность YFP и Cl⁻ нечувствительность к CFP. Кломелеон^[4] и Cl⁻ Датчик^[5] представляют собой индикаторы Cl на основе FRET, которые позволяют ратиометрически неинвазивно контролировать активность хлоридов в живых клетках.

Примечания

1. Веркман 1990 г.
2. Wachter & Remington 1999
3. Jayaraman et al. 2000 г.
4. Кунер и Августин 2000
5. Маркова и др. 2008 г.

Рекомендации

• Веркман, А.С. (1990). «Разработка и биологические применения хлорид-чувствительных флуоресцентных индикаторов». Американский журнал физиологии. 259 (3, часть 1): C375 – C388. Дои:10.1152 / ajpcell.1990.259.3.C375. PMID  2205105.
• Вахтер, РМ; Ремингтон, SJ (1999). «Чувствительность желтого варианта зеленого флуоресцентного белка к галогенидам и нитратам». Текущая биология. 9 (17): R628 – R629. Дои:10.1016 / S0960-9822 (99) 80408-4. PMID  10508593. S2CID  1178098.
• Джаяраман, S; Хэгги, П; Вахтер, РМ; Ремингтон, SJ; Веркман, А.С. (2000). "Механизм и клеточные применения галогенидного сенсора на основе зеленого флуоресцентного белка". Журнал биологической химии. 275 (9): 6047–6050. Дои:10.1074 / jbc.275.9.6047. PMID  10692389.
• Кунер, Т; Августин, GJ (2000). «Генетически закодированный ратиометрический индикатор хлорида: захват транзитных хлоридов в культивируемых нейронах гиппокампа». Нейрон. 27 (3): 447–459. Дои:10.1016 / S0896-6273 (00) 00056-8. PMID  11055428. S2CID  18494393.
• Маркова, О; Мухтаров, М; Реальный, E; Джейкоб, Y; Брегестовски, П (2008). «Генетически кодируемый хлоридный индикатор с повышенной чувствительностью». Журнал методов неврологии. 170 (1): 67–76. Дои:10.1016 / j.jneumeth.2007.12.016. PMID  18279971. S2CID  15427384.

внешняя ссылка