Кассета без G - G-less cassette

В Кассета без G анализ транскрипции - метод, используемый в молекулярная биология определить промоутер сила in vitro. Методика включает количественную оценку продукта мРНК с использованием плазмиды.[1] Кассета без G является частью заранее сконструированного вектора, обычно содержащего сайт множественного клонирования (MCS) перед кассетой. По этой причине интересующие промоторы могут быть вставлены непосредственно в MCS, чтобы в конечном итоге измерить точность и эффективность промотора в рекрутировании аппарата транскрипции.

Промотор клонируется в
Кассетная плазмида без G.
(а) Предварительно созданная плазмида с 365-нуклеотидной G-менее смысловой цепью подвергается вставке промотора. (б) Промотор клонируется в сайт множественного клонирования (MCS) непосредственно перед сайтом начала транскрипции. Для расшифровки кассеты без G используется полимераза. После того, как кассета была расшифрована и первый гуанозинтрифосфат в смысловой цепи за пределами кассеты обнаружен, транскрипция преждевременно завершается. Выпускается 365-нуклеотидный транскрипт с радиоактивной меткой. Транскрипты, полученные в кассетном анализе без G, могут быть подвергнуты гель-электрофорезу для подтверждения их длины и авторадиографии для определения относительной силы промотора.

Метод

Кассета G-less - это репортерный ген кодирует стенограмму, в которой отсутствует гуанин нуклеотиды в смысл цепь ДНК (отсюда "грамм-меньше").[2] Плазмида, содержащая такой ген, расположена ниже MCS. После того, как промотор вставлен в MCS, транскрипция продолжается с добавлением радиоактивно меченных UTP, CTP и ATP (а также нерадиоактивных / холодных нуклеотидов) и продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец кассеты без G и остатки гуанина снова не станут очевидными в смысловой цепи ДНК. . Отсутствие ГТФ in vitro приводит к преждевременному окончанию транскрипции на первом остатке гуанина в смысловой цепи, следующей за кассетой. Гель-электрофорез выполняется на продуктах транскрипции, и количество радиоактивности определяется количественно авторадиография или же фосфорное изображение для определения силы интересующего промоутера.

Заявление

Кассетный метод без G используется для определения силы промотора за пределами базальных уровней транскрипции (т. Е. В присутствии активаторы транскрипции или же факторы транскрипции[3]). Например, чтобы измерить влияние Коробка ТАТА консенсусная последовательность модификация в Saccharomyces cerevisiae в присутствии TFIID Кассеты без G были использованы для измерения относительной силы каждого промотора.[4]

Преимущества

Анализ без G можно проводить на кольцевой плазмиде для измерения уровней транскрипции. Кольцевая плазмида обеспечивает более эффективную матрицу во многих системах по сравнению с другими анализами, такими как текущая транскрипция, в которых требуется отщепленный конец. Этот метод очень эффективно генерирует радиоактивно меченые транскрипты, поскольку он позволяет обойти ненужный процесс выполнения других косвенных измерений продукта мРНК. Промотор вставляется в кольцевую плазмиду, содержащую кассету без G, которая будет генерировать транскрипт определенной длины, исключающий случайную и неспецифическую транскрипцию по всей плазмиде. Большинство неочищенных систем, таких как ядерные экстракты HeLa, используются, потому что они содержат небольшое количество загрязняющего GTP, что приводит к фоновой транскрипции и может иногда вызывать случайную транскрипцию для чтения через кассету без G.[5]

Рекомендации

  1. ^ Парк, JH; Маган, Н (12.11.2014). «Связанный с обратной транскриптазой количественный ПЦР-анализ в реальном времени бесклеточной транскрипции на промоторе p21, собранном из хроматина». PLOS ONE. 6 (8): e23617. Дои:10.1371 / journal.pone.0023617. ЧВК  3160311. PMID  21886803.
  2. ^ Ария Баниахмад (2002). Рецепторы гормонов щитовидной железы: методы и протоколы. Springer Science & Business Media. п. 211. ISBN  978-1-59259-174-9.
  3. ^ Казеруниния, А; Нго, B; Мартинсон, Герберт (12 ноября 2014 г.). «Зависимая от сигнала поли (А) деградация необработанных растущих транскриптов сопровождает зависимую от сигнала поли (А) транскрипционную паузу in vitro». РНК. 16 (1): 197–210. Дои:10.1261 / rna.1622010. ЧВК  2802029. PMID  19926725.
  4. ^ Бьорнсдоттир, G; Майерс, LC (12 ноября 2014 г.). «Минимальные компоненты аппарата транскрипции РНК-полимеразы II определяют консенсусный ТАТА-бокс». Нуклеиновые кислоты Res. 36 (9): 2906–16. Дои:10.1093 / nar / gkn130. ЧВК  2396422. PMID  18385157.
  5. ^ Кэри, MF; Петерсон, К.Л .; Смейл, СТ (12 ноября 2014 г.). «G-less кассета для транскрипции in vitro с использованием ядерных экстрактов клеток HeLa». Холодный источник Харб Проток. 2010 (3): pdb.prot5387. Дои:10.1101 / pdb.prot5387. PMID  20194456.