Джин стук-в - Gene knock-in

В молекулярное клонирование и биология, а подбивание (или же генная нокаутация) относится к генная инженерия метод, который включает замену информации о последовательности ДНК в генетическом локусе один-к-одному или вставку информации о последовательности, не обнаруженной в локусе.[1] Обычно это делается на мышах, поскольку технология для этого процесса более совершенная и существует высокая степень сложности общих последовательностей между мышами и людьми.[2] Отличие технологии подбивания от традиционной трансгенный Методы состоят в том, что в нокаут вовлекается ген, вставленный в конкретный локус, и, таким образом, вставка является «целевой». Это противоположность нокаут гена.

Обычное использование технологии подстановки - создание моделей болезней. Это метод, с помощью которого научные исследователи могут изучать функцию регулирующего механизма (например, промоутеры ), который регулирует экспрессию заменяемого природного гена. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В БАК и YAC в этом случае используются для передачи больших фрагментов.

Техника

Нокаут генов возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом, Оливером Смитисом и Марио Капеччи. Традиционно, методы «нокаута» основывались на гомологичной рекомбинации для запуска целевой замены гена, хотя были разработаны другие методы, использующие опосредованную транспозоном систему для вставки целевого гена.[3] Использование loxP Примером этого являются фланкирующие сайты, которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre с генными векторами. Эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией затем имплантируются в жизнеспособную бластоцисту, которая вырастет в зрелую химерную мышь с некоторыми клетками, имеющими генетическую информацию исходных клеток бластоцисты, и другими клетками, имеющими модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь этот ген.[4]

Внедрение генов позволило впервые провести основанные на гипотезах исследования модификаций генов и полученных фенотипов. Мутации в гене р53 человека, например, могут быть вызваны воздействием бензо (а) пирена (BaP), а мутированная копия гена р53 может быть вставлена ​​в геномы мыши. Опухоли легких, наблюдаемые у мышей с нокаутом, подтверждают гипотезу о BaP. канцерогенность.[5] Более поздние разработки в технике «нокаута» позволили свиньям иметь ген зеленого флуоресцентного белка, вставленный с CRISPR / Cas9 система, которая позволяет гораздо более точно и успешно вставлять гены.[6] Скорость включения CRISPR / Cas9-опосредованного гена также позволяет генерировать двуаллельные модификации некоторых генов и фенотипа у мышей, наблюдаемого в одном поколении, в беспрецедентные сроки.[7]

Против нокаута гена

Технология Knock-in отличается от нокаутировать Технология в этой технологии нокаута направлена ​​либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК, чтобы нарушить экспрессию определенного генетического локуса. С другой стороны, технология "нокаута" изменяет интересующий генетический локус посредством замены информации о последовательности ДНК один на один или путем добавления информации о последовательности, которая не обнаруживается в указанном генетическом локусе. Следовательно, нокаут гена можно рассматривать как усиление функциональной мутации, а нокаут гена - как потерю функциональной мутации, но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, что приводит к некоторой потере функции.[8]

Возможные приложения

Благодаря успеху методов «нокаута» генов можно предвидеть множество клинических применений. Врезка секций человека ген иммуноглобулина в мышей уже было показано, что позволяет им продуцировать гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными.[9] Должна быть возможность изменить стволовые клетки у человека для восстановления функции целевого гена в определенных тканях, например, возможно, исправляя мутантный ген гамма-цепи Рецептор ИЛ-2 в гемопоэтических стволовых клетках для восстановления развития лимфоцитов у людей с Х-сцепленным тяжелый комбинированный иммунодефицит.[4]

Ограничения

В то время как технология подстановки генов оказалась мощным методом для создания моделей болезней человека и понимания белков in vivo, по-прежнему существуют многочисленные ограничения. Многие из них совпадают с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации генов-нокаутов приводят к усложнению взаимодействий, которые встроенные гены и их продукты имеют с другими участками генома, и, следовательно, могут привести к большему количеству побочных эффектов и трудностей для объяснения. фенотипы. Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, были охарактеризованы достаточно хорошо, чтобы их можно было использовать для условных нокаутов генов; создание комбинаций репортер и трансгены в том же локусе проблематичны. Самый большой недостаток использования гена для создания модели заболевания человека заключается в том, что физиология мыши не идентична физиологии человека и человека. ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не полностью отражает роль гена в патологии человека.[10] Это можно увидеть на мышах, выращенных с ΔF508 мутация фиброза в Ген CFTR, на который приходится более 70% мутаций в этом гене в человеческой популяции и приводит к муковисцидозу. Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для мутации человека, они не проявляют легочных патофизиологических изменений, наблюдаемых у людей, и практически не несут легочного фенотипа.[11] Такие проблемы можно решить с помощью использования различных моделей животных, и модели свиней (легкие свиньи имеют много биохимических и физиологических сходств с легкими человека) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508.[12]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Гибсон, Грег (2009). Учебник по геномной науке, 3-е изд.. Сандерленд, Массачусетс: Синауэр. С. 301–302. ISBN  978-0-87893-236-8.
  2. ^ Консорциум по секвенированию генома мышей; Уотерстон, Роберт Х .; Линдблад-То, Керстин; Бирни, Юэн; Роджерс, Джейн; Abril, Josep F .; Агарвал, Панкадж; Агарвала, Рича; Эйнскау, Рэйчел (2002-12-05). «Первоначальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши». Природа. 420 (6915): 520–562. Bibcode:2002 Натур. 420..520Вт. Дои:10.1038 / природа01262. ISSN  0028-0836. PMID  12466850.
  3. ^ Westphal, C.H .; Ледер, П. (1997-07-01). «Созданные транспозоном конструкции для нацеливания на ген« нокаут »и« нокаут »для использования на мышах». Текущая биология. 7 (7): 530–533. Дои:10.1016 / s0960-9822 (06) 00224-7. ISSN  0960-9822. PMID  9210379.
  4. ^ а б Манис, Джон П. (2007-12-13). «Нокаутируй, сбивай, сбивай - генетически модифицированные мыши и Нобелевская премия». Медицинский журнал Новой Англии. 357 (24): 2426–2429. Дои:10.1056 / NEJMp0707712. ISSN  1533-4406. PMID  18077807.
  5. ^ Лю, Чжипэй; Мюльбауэр, Карл-Рудольф; Schmeiser, Heinz H .; Хергенхан, Манфред; Белхаразем, Джеда; Холлштейн, Моника К. (1 апреля 2005 г.). «Мутации р53 в человеческих фибробластах, подвергнутых воздействию бензо (а) пирена, коррелируют с мутациями р53 в опухолях легких человека». Исследования рака. 65 (7): 2583–2587. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-04-3675. ISSN  0008-5472. PMID  15805253.
  6. ^ Руань, Цзиньсюэ; Ли, Хэган; Сюй, Куи; Ву, Тяньвэнь; Вэй, Цзинлян; Чжоу, Ронг; Лю, Чжиго; Му, Юлиан; Ян, Шулин (2015-09-18). «Высокоэффективный CRISPR / Cas9-опосредованный нокин трансгена в локусе H11 у свиней». Научные отчеты. 5: 14253. Bibcode:2015НатСР ... 514253Р. Дои:10.1038 / srep14253. ЧВК  4585612. PMID  26381350.
  7. ^ Ван, Яньлян; Ли, Цзюньхун; Сян, Цзиньчжу; Вэнь, Бинцян; Му, Хайюань; Чжан, Вэй; Хан, Цзяньюн (10 декабря 2015 г.). «Высокоэффективное создание двуаллельных репортерных мышей с нокаутом генома посредством CRISPR-опосредованного редактирования генома ESC». Белки и клетки. 7 (2): 152–156. Дои:10.1007 / s13238-015-0228-3. ISSN  1674-800X. ЧВК  4742388. PMID  26661644.
  8. ^ Дойл, Альфред; МакГарри, Майкл П .; Ли, Нэнси А .; Ли, Джеймс Дж. (2012-04-01). «Построение трансгенных и генных моделей болезней человека с нокаутом / нокаутом на мышах». Трансгенные исследования. 21 (2): 327–349. Дои:10.1007 / s11248-011-9537-3. ISSN  0962-8819. ЧВК  3516403. PMID  21800101.
  9. ^ Бенатуил, Лоренцо; Кэй, Джоэл; Кретин, Натали; Годвин, Джонатан Дж .; Кариаппа, Аннаия; Пиллай, Шив; Якомини, Джон (2008-03-15). «Мыши с нокаутом Ig, продуцирующие антиуглеводные антитела: прорыв В-клеток, продуцирующих низкоаффинные анти-собственные антитела». Журнал иммунологии. 180 (6): 3839–3848. Дои:10.4049 / jimmunol.180.6.3839. ISSN  0022-1767. PMID  18322191.
  10. ^ Теллькамп, Фредерик; Бенхаду, Фарида; Бремер, Йерун; Гнарра, Мария; Кнювер, Яна; Шаффенрат, Сандра; Ворхаген, Сюзанна (01.12.2014). «Технология трансгенных мышей в биологии кожи: создание мышей с нокаутом». Журнал следственной дерматологии. 134 (12): 1–3. Дои:10.1038 / jid.2014.434. ISSN  1523-1747. PMID  25381772.
  11. ^ Grubb, Barbara R .; Баучер, Ричард К. (1999-01-01). "Патофизиология генно-ориентированных моделей мышей для муковисцидоза". Физиологические обзоры. 79 (1): S193 – S214. Дои:10.1152 / физрев.1999.79.1.S193. ISSN  0031-9333. PMID  9922382.
  12. ^ Роджерс, Кристофер С .; Хао, Яньхун; Рохлина, Татьяна; Самуэль, Мелисса; Штольц, Дэвид А .; Ли, Юхонг; Петров, Елена; Vermeer, Daniel W .; Кабель, Аманда С. (1 апреля 2008 г.). «Производство CFTR-нулевых и CFTR-DeltaF508 гетерозиготных свиней с помощью аденоассоциированного вируса нацеливания на гены и переноса ядра соматических клеток». Журнал клинических исследований. 118 (4): 1571–1577. Дои:10.1172 / JCI34773. ISSN  0021-9738. ЧВК  2265103. PMID  18324337.

внешняя ссылка