Маркировка иммунного золота - Immunogold labelling

Два изображения, полученные с использованием маркировки иммунным золотом и просвечивающей электронной микроскопии: (A) частицы золота маркируют мтДНК рядом с митохондрии (B) мтДНК, отмеченная частицами золота после экстракции.[1]

Маркировка иммунного золота или Иммунное окрашивание (IGS) - это метод окрашивания, используемый в электронная микроскопия.[2] Эта техника окрашивания соответствует тем же образцам Непрямая иммунофлуоресценция: коллоидное золото частицы чаще всего прикрепляются к вторичным антитела которые, в свою очередь, прикреплены к первичные антитела предназначен для связывания конкретных антиген или другой ячейка составная часть. Золото используется для электронная плотность что увеличивает электрон разброс, чтобы получить высококонтрастные «темные пятна».[3]

Впервые использованная в 1971 г., маркировка иммунным золотом применялась как к просвечивающая электронная микроскопия и сканирующая электронная микроскопия, а также светлопольная микроскопия. Техника маркировки может быть адаптирована для различения нескольких объектов с использованием золотых частиц разного размера.

Маркировка иммунным золотом может привести к появлению артефактов, поскольку частицы золота находятся на некотором расстоянии от помеченного объекта, и во время подготовки образца требуется очень тонкое сечение.[3]

История

Мечение иммунным золотом было впервые использовано в 1971 г. Фолком и Тейлором для идентификации Сальмонелла антигены.[2][4] Впервые он был применен в просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и был особенно полезен для выделения белки обнаружены в низкой плотности, например, некоторые антигены клеточной поверхности.[5] По мере увеличения разрешения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) увеличивалась и потребность в этикетках размером с наночастицы, таких как иммунное золото. В 1975 году Хорисбергер и его коллеги успешно визуализировали наночастицы золота диаметром менее 30 нм.[6]и вскоре это стало общепринятой техникой SEM.[5]

Техника

Сначала вырезают тонкий срез образца, часто используя микротом.[7] Различные другие этапы Базовые приготовления может тогда иметь место.

Подготовленный образец затем инкубируют со специфическим антителом, предназначенным для связывания интересующей молекулы.[3] Затем добавляется вторичное антитело, к которому прикреплены частицы золота, и оно связывается с первичным антителом. Золото также можно прикрепить к белок А или белок G вместо вторичного антитела, поскольку эти белки связывают IgG Fc регионы неспецифическим образом.[6]

Электронно-плотную частицу золота теперь можно увидеть под электронным микроскопом в виде черной точки, косвенно маркирующей интересующую молекулу.[3]

Маркировка нескольких объектов

Мечение Immunogold можно использовать для одновременной визуализации более чем одной мишени. Этого можно добиться в электронная микроскопия с помощью двух золотых частиц разного размера.[8] Расширение этого метода использовало три частицы золота разного размера для отслеживания локализации регуляторных пептиды.[9] Более сложный метод многосайтовой маркировки включает маркировку противоположных сторон антигенный сайт по отдельности частицы иммунозолота, прикрепленные к обеим сторонам, затем можно рассматривать одновременно.[10]

Использование в светлопольной микроскопии

Хотя мечение иммунным золотом обычно используется для просвечивающей электронной микроскопии, когда золото «усилено серебром», это можно увидеть, используя светлопольная микроскопия.[11] Увеличение серебра увеличивает размер частиц, что также делает возможной сканирующую электронную микроскопию. Чтобы получить частицы золота с усиленным серебром, частицы коллоидного золота помещают в кислый усиление решение содержащий серебро ионы. Затем золотые частицы действуют как зарождение сайт и серебро осаждается на частицу. Примером применения маркировки иммунным золотом, усиленной серебром (IGSS), была идентификация возбудитель Эрвиния амиловора.[11]

Ограничения

Неотъемлемым ограничением метода иммунного золота является то, что частица золота находится на расстоянии около 15-30 нм от сайта, с которым связано первичное антитело.[5] (при использовании первичные и вторичные антитела стратегия маркировки). Поэтому точное местоположение целевой молекулы невозможно точно рассчитать. Золотые частицы могут быть созданы диаметром 1нм (или ниже), но тогда реализуется другое ограничение - при таких размерах золотую этикетку становится трудно отличить от структуры ткани.[2][5]

Для маркировки иммунозолотом требуются тонкие срезы, которые могут создавать вводящие в заблуждение изображения; тонкий срез клеточного компонента может не дать точного представления о его трехмерная структура. Например, микротрубочка может появиться как «шип» в зависимости от того, на какой плоскости произошло разрезание. Чтобы преодолеть это ограничение, можно взять серийные разделы, которые затем можно скомпилировать в трехмерный образ.[3]

Еще одним ограничением является то, что антитела и частицы золота не могут проникать через смола используется для вставки образцов для визуализации. Таким образом, могут быть нацелены и визуализированы только доступные молекулы. Маркировка перед заливкой образца может снизить негативное влияние этого ограничения.[3]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Иборра Ф.Дж., Кимура Х., Кук PR (2004). «Функциональная организация митохондриальных геномов в клетках человека». BMC Biol. 2: 9. Дои:10.1186/1741-7007-2-9. ЧВК  425603. PMID  15157274.
  2. ^ а б c «Мечение иммунным золотом в сканирующей электронной микроскопии». Архивировано из оригинал на 2014-02-06. Получено 2010-07-08.
  3. ^ а б c d е ж Альбертс, Брюс; и другие. (2008). Молекулярная биология клетки (5-е изд.). Нью-Йорк: Наука о гирляндах. ISBN  978-0-8153-4106-2.
  4. ^ Фолк В.П., Тейлор GM (ноябрь 1971 г.). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия. 8 (11): 1081–3. Дои:10.1016/0019-2791(71)90496-4. PMID  4110101.
  5. ^ а б c d Германн Р., Вальтер П., Мюллер М. (1996). «Мечение иммунозолотом в сканирующей электронной микроскопии». Гистохимия и клеточная биология. 106 (1): 31–39. Дои:10.1007 / BF02473200. PMID  8858365.
  6. ^ а б Рот Дж, Бендаян М., Орчи Л. (декабрь 1978 г.). «Ультраструктурная локализация внутриклеточных антигенов с помощью комплекса протеин А-золото». J. Histochem. Cytochem. 26 (12): 1074–81. Дои:10.1177/26.12.366014. PMID  366014. Архивировано из оригинал на 2008-09-07. Получено 2010-07-08.
  7. ^ Портер, К; Блюм, Дж (1953). «Исследование микротомии для электронной микроскопии». Анатомический рекорд. 117 (4): 685–710. Дои:10.1002 / ар.1091170403. PMID  13124776.
  8. ^ Рот Дж., Биндер М (март 1978 г.). «Колоидное золото, ферритин и пероксидаза в качестве маркеров для электронно-микроскопических методов двойного мечения лектинов». J. Histochem. Cytochem. 26 (3): 163–9. Дои:10.1177/26.3.632554. PMID  632554. Получено 2010-07-18.[постоянная мертвая ссылка ]
  9. ^ Тапиа Ф.Дж., Варнделл И.М., Проберт Л., Де Мей Дж., Полак Дж. М. (июль 1983 г.). «Метод двойного иммунозолота для одновременной ультраструктурной локализации регуляторных пептидов». J. Histochem. Cytochem. 31 (7): 977–81. Дои:10.1177/31.7.6189888. PMID  6189888. Получено 2010-07-18.[постоянная мертвая ссылка ]
  10. ^ Бендаян М. (январь 1982 г.). «Двойное иммуноцитохимическое мечение с применением метода протеина А-золота». J. Histochem. Cytochem. 30 (1): 81–5. Дои:10.1177/30.1.6172469. PMID  6172469. Получено 2010-07-18.[постоянная мертвая ссылка ]
  11. ^ а б Ван Лаэр О., Де Ваэль Л., Де Мей Дж. (1985). «Иммуно-золотое окрашивание (IGS) и иммуно-золотое окрашивание (IGSS) для идентификации патогенной бактерии растений Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al». Гистохимия. 83 (5): 397–9. Дои:10.1007 / BF00509198. PMID  2416717.