Изобарическая маркировка - Isobaric labeling

Схема изобарного мечения: белки извлекаются из различных условий или типов клеток, перевариваются в пептиды и маркируются изобарными метками стабильных изотопов. Эти теги состоят из репортерной, балансовой и реактивной областей. Более легкие репортерные области спариваются с более тяжелыми областями баланса, так что весь тег, прикрепленный к пептиду, добавляет такой же сдвиг массы. Поэтому после смешивания в MS1, пептиды появляются как один предшественник. Однако при фрагментации во время РС2В дополнение к нормальным ионам фрагментов, репортерные области диссоциируют с образованием ионных сигналов, которые предоставляют количественную информацию об относительном количестве пептида в образцах.

Изобарическая маркировка это масс-спектрометрии стратегия, используемая в количественная протеомика. Пептиды или же белки помечены различными химическими группами, которые имеют (по крайней мере номинально) идентичные массы (изобарические), но различаются с точки зрения распределения тяжелых изотопов по их структуре. Эти теги, обычно называемые тандемными массовыми тегами, спроектированы таким образом, что массовый тег расщепляется в определенной области линкера при высокой энергии. CID (HCD) во время тандемная масс-спектрометрия с получением репортерных ионов разной массы. Наиболее распространенными изобарическими метками являются метки, реагирующие с амином.[1] Однако также описаны метки, которые реагируют с остатками цистеина и карбонильными группами.[2] Эти группы, реагирующие с амином, проходят реакции N-гидроксисукцинимида (NHS), в основе которых лежат три типа функциональных групп.[2] Методы изобарической маркировки включают: тандемные массовые метки (TMT), изобарные метки для абсолютного и относительного количественного анализа (iTRAQ), метки дифференциальной массы для абсолютного и относительного количественного определения и маркировка диметилом.[1] Методы TMT и iTRAQ являются наиболее распространенными и развитыми из этих методов.[1] Тандемные массовые метки имеют область репортера массы, область расщепляемого линкера, область нормализации массы и группу, реагирующую с белком, и имеют одинаковую общую массу.[3]

Рабочий процесс

Типичный восходящая протеомика рабочий процесс описан (Yates, 2014).[2] Образцы белка ферментативно перевариваются протеаза производить пептиды. Каждый переваренный экспериментальный образец является производным с различным изотопным вариантом метки из набора. Образцы обычно смешиваются в равных соотношениях и анализируются одновременно за один прогон МС. Поскольку метки являются изобарическими и имеют идентичные химические свойства, изотопные варианты меток появляются как один составной пик с одинаковым значением m / z при сканировании MS1 с одинаковыми временами удерживания жидкостной хроматографии (ЖХ). Во время жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) анализ, фрагментированные пептиды производят ионы продукта, специфичные для последовательности. Эти ионы продукта используются для определения пептидной последовательности и репортерных меток, количество которых отражает относительное соотношение пептида в образцах, которые были объединены. Для обнаружения меток требуется использование MS / MS, поэтому немеченые пептиды не оцениваются.

Преимущества

Объяснено ранее (Lee, Choe, Aggarwal, 2017).[4] Ключевым преимуществом изобарической маркировки по сравнению с другими методами количественной оценки (например, без метки) является возможность мультиплексирования и, следовательно, повышенная пропускная способность. Возможность комбинировать и анализировать несколько образцов одновременно в одном цикле ЖХ-МС устраняет необходимость анализа нескольких наборов данных и устраняет вариации от цикла к циклу. Мультиплексирование снижает вариабельность обработки образцов, повышает специфичность за счет одновременного количественного определения пептидов для каждого состояния и сокращает время обработки нескольких образцов. Без мультиплексирования информация может быть упущена от цикла к запуску, что влияет на идентификацию и количественную оценку, поскольку пептиды, выбранные для фрагментации в одном цикле ЖХ-МС / МС, могут не присутствовать или иметь подходящее количество в последующих циклах образцов. Доступные в настоящее время изобарические химические метки облегчают одновременный анализ от 2 до 11 экспериментальных образцов.

Приложения

Комплект ITRAQ 8plex

Изобарическое маркирование успешно используется для многих биологических применений, включая идентификацию и количественную оценку белков, определение профиля экспрессии белков при нормальных и аномальных состояниях, количественный анализ белков, для которых отсутствуют антитела, а также идентификацию и количественную оценку посттрансляционно модифицированных белков.[4]

Доступность

В продаже имеются два типа изобарных меток: тандемные массовые метки (TMT) и изобарные метки для относительного и абсолютного количественного определения (iTRAQ). Аминно-реактивный TMT доступен в двух вариантах: дуплекс, 6 и 10, а теперь и наборы из 11 сплетений.[5] Реагирующий с амином iTRAQ доступен в 4-х и 8-ми вариантах.[6] формы.


Рекомендации

  1. ^ а б c Банчефф, Маркус; Лемеер, Симона; Савицкий, Михаил М .; Кустер, Бернхард (01.09.2012). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: обновление критического обзора с 2007 г. по настоящее время». Аналитическая и биоаналитическая химия. 404 (4): 939–965. Дои:10.1007 / s00216-012-6203-4. ISSN  1618-2650. PMID  22772140.
  2. ^ а б c Йетс, Джон (2014). "Относительная количественная оценка на основе изобарической маркировки в протеомике дробовика". Журнал протеомных исследований. 13 (12): 5293–5309. Дои:10.1021 / pr500880b. ЧВК  4261935. PMID  25337643.
  3. ^ Томпсон, Эндрю; Шефер, Юрген; Кун, Карстен; Кинле, Стефан; Шварц, Йозеф; Шмидт, Гюнтер; Нойман, Томас; Хамон, Кристиан (2003). «Тандемные массовые теги: новая стратегия количественной оценки для сравнительного анализа сложных белковых смесей с помощью МС / МС». Аналитическая химия. 75 (8): 1895–1904. Дои:10.1021 / ac0262560. ISSN  0003-2700. PMID  12713048.
  4. ^ а б Ли, Кельвин Х .; Choe, Leila H .; Аггарвал, Кунал (01.06.2006). «Протеомика дробовика с использованием изобарных тегов iTRAQ». Брифинги по функциональной геномике. 5 (2): 112–120. Дои:10.1093 / bfgp / ell018. ISSN  2041-2649. PMID  16772272.
  5. ^ Дайон Л., Хайнард А., Ликер В., Терк Н., Кун К., Хохштрассер Д. Ф., Буркхард П. Р., Санчес Дж. К. (2008). «Относительное количественное определение белков в спинномозговой жидкости человека с помощью МС / МС с использованием 6-плексных изобарических меток». Анальный. Chem. 80 (8): 2921–31. Дои:10.1021 / ac702422x. PMID  18312001.
  6. ^ Чоу Л., Д'Асенцо М, Релкин Н.Р., Паппин Д., Росс П., Уильямсон Б., Гертин С., Прибил П., Ли К.Х. (2007). «Количественное определение 8-plex изменений в экспрессии белков спинномозговой жидкости у субъектов, проходящих внутривенное лечение иммуноглобулином по поводу болезни Альцгеймера». Протеомика. 7 (20): 3651–60. Дои:10.1002 / pmic.200700316. ЧВК  3594777. PMID  17880003.