Количественная протеомика - Quantitative proteomics

Количественная масс-спектрометрия.

Количественная протеомика является аналитическая химия методика определения количества белки в образце.[1][2][3] Методы идентификации белков идентичны тем, которые используются в целом (т.е. качественные). протеомика, но включить количественную оценку в качестве дополнительного параметра. Вместо того, чтобы просто предоставлять списки белков, идентифицированных в определенном образце, количественная протеомика дает информацию о физиологических различиях между двумя биологическими образцами. Например, этот подход можно использовать для сравнения образцов от здоровых и больных пациентов. Количественная протеомика в основном выполняется двумерный гель-электрофорез (2-DE) или масс-спектрометрия (MS). Однако недавно разработанный метод количественный дот-блот (QDB) анализ может измерять как абсолютное, так и относительное количество отдельных белков в образце в формате высокой производительности, что открывает новое направление для протеомных исследований. В отличие от 2-DE, который требует MS для последующей идентификации белков, технология MS может идентифицировать и количественно определять изменения.

Количественная оценка с помощью спектрофотометрии

Концентрация определенного белка в образце может быть определена с помощью спектрофотометрических процедур.[4] Концентрацию белка можно определить путем измерения OD при 280 нм на спектрофотометре, который можно использовать с анализом стандартной кривой для количественного определения присутствия триптофана, тирозина и фенилаланина.[5] Однако этот метод не самый точный, потому что состав белков может сильно различаться, и этот метод не позволяет количественно определять белки, не содержащие вышеупомянутые аминокислоты. Этот метод также неточен из-за возможности загрязнения нуклеиновой кислотой. Другие более точные спектрофотометрические процедуры количественного определения белка включают: Биурет, Лоури, BCA, и Брэдфорд методы.

Количественное определение с помощью двумерного электрофореза

Двумерный гель-электрофорез (2-DE) представляет собой одну из основных технологий количественной протеомики с достоинствами и недостатками. 2-DE предоставляет информацию о количестве белка, заряде и массе интактного белка. Он имеет ограничения для анализа белков размером более 150 кДа или менее 5 кДа и белков с низкой растворимостью. Количественная МС имеет более высокую чувствительность, но не дает информации об интактном белке.

Классический 2-DE, основанный на постэлектрофоретическом окрашивании красителем, имеет ограничения: для проверки воспроизводимости требуется не менее трех технических повторов.[нужна цитата ] Отличие гель-электрофореза (DIGE) использует метку белков на основе флуоресценции перед разделением, что повысило точность количественной оценки, а также чувствительность обнаружения белков.[нужна цитата ] Таким образом, DIGE представляет собой основной текущий подход к изучению протеомов на основе 2-DE.[нужна цитата ]

Количественное определение с помощью масс-спектрометрии

Примеры количественных протеомных рабочих процессов. Красный цвет представляет интересующий физиологический образец, а синий - контрольный образец. Белые прямоугольники обозначают области, в которых наиболее вероятно возникновение ошибок, а фиолетовые прямоугольники обозначают места смешения образцов.[6]

Масс-спектрометрия (МС) представляет собой одну из основных технологий количественной протеомики с достоинствами и недостатками. Количественная МС имеет более высокую чувствительность, но может предоставить лишь ограниченную информацию об интактном белке. Количественный МС использовался как для открытия, так и для целевого протеомного анализа, чтобы понять глобальную протеомную динамику в популяциях клеток (массовый анализ)[7] или в отдельных клетках (одноклеточный анализ).[8][9]

Ранние подходы, разработанные в 1990-х годах, применялись изотопно-кодированные аффинити-теги (ICAT), в котором используются два реагента с тяжелыми и легкими изотопами, соответственно, и метка сродства к биотину для модификации цистеинсодержащих пептидов. Эта технология использовалась для маркировки целых Saccharomyces cerevisiae клетки[10] и вместе с масс-спектрометрии, помог заложить основы количественной протеомики. Этот подход был заменен метками изобарической массы.[7], которые также используются для анализа одноклеточных белков.[11].

Относительная и абсолютная количественная оценка

Масс-спектрометрия по своей сути не является количественной из-за различий в эффективности ионизации и / или обнаруживаемости многих пептидов в данном образце, что послужило толчком для разработки методов определения относительного и абсолютного содержания белков в образцах.[3] Интенсивность пика в масс-спектр не является хорошим индикатором количества аналита в образце, хотя различия в пиковой интенсивности одно и тоже анализируемое вещество между несколькими образцами точно отражает относительные различия в его содержании.

Мечение стабильных изотопов в масс-спектрометрии

Этикетки стабильных изотопов

Подход к относительному количественному определению, который является более дорогостоящим и трудоемким, хотя и менее чувствителен к экспериментальной систематической ошибке, чем количественное определение без метки, влечет за собой маркировку образцов стабильный изотоп метки, позволяющие масс-спектрометру различать идентичные белки в отдельных образцах. Один тип метки, изотопные метки, состоит из стабильных изотопов, включенных в белковые сшивающие агенты, которые вызывают известный сдвиг массы меченого белка или пептида в масс-спектре. Различно меченые образцы объединяются и анализируются вместе, и различия в пиковых интенсивностях пар изотопов точно отражают разницу в содержании соответствующих белков.

Абсолютный протеомный количественный анализ с использованием изотопных пептидов влечет за собой повышение известных концентраций синтетических тяжелых веществ. изотопологи целевых пептидов в экспериментальный образец и затем проводят ЖХ-МС / МС. Как и в случае относительного количественного определения с использованием изотопных меток, пептиды одинакового химического состава совместно элюируются и анализируются с помощью МС одновременно. Однако, в отличие от относительной количественной оценки, содержание целевого пептида в экспериментальном образце сравнивается с содержанием тяжелого пептида и рассчитывается с учетом исходной концентрации стандарта с использованием предварительно определенной стандартной кривой для получения абсолютного количественного определения целевой пептид.

Методы относительной количественной оценки включают: изотопно-кодированные аффинити-теги (ICAT), изобарическая маркировка (тандемные массовые теги (TMT) и изобарные метки для относительного и абсолютного количественного определения (iTRAQ)), количественная оценка без этикеток метки с металлической кодировкой (MeCAT ), Маркировка N-терминала, мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (СИЛАК ), и изотопное мечение субстратов терминальным амином (ХВОСТ). Появился математически строгий подход, который объединяет интенсивности пептидов и согласованность измерений пептидов в доверительные интервалы для соотношений белков.[12]

Абсолютная количественная оценка выполняется с использованием мониторинг выбранных реакций (SRM).

Металлические бирки

Метод меток с металлическими кодами (MeCAT) основан на химической маркировке, но вместо использования стабильных изотопов используются различные ионы лантаноидов в макроциклических комплексах. Количественная информация поступает из измерений меченых пептидов методом МС с индуктивно связанной плазмой. MeCAT можно использовать в сочетании с элементной масс-спектрометрией. ИСП-МС позволяя впервые произвести абсолютное количественное определение металла, связанного реагентом MeCAT с белком или биомолекулой. Таким образом, можно определить абсолютное количество белка вплоть до аттомольного диапазона, используя внешнюю калибровку стандартным раствором металла. Он совместим с разделением белков с помощью 2D-электрофореза и хроматографии в мультиплексных экспериментах. Идентификацию белка и относительную количественную оценку можно выполнить с помощью MALDI-MS / MS и ESI-MS / MS.

Масс-спектрометры обладают ограниченной способностью обнаруживать пептиды с низким содержанием в образцах с высоким динамическим диапазоном. Ограниченный рабочий цикл масс-спектрометров также ограничивает частоту столкновений, что приводит к недостаточной выборке.[13] Протоколы подготовки образцов представляют собой источники экспериментальной ошибки.

Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток

Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (СИЛАК ) представляет собой метод, который включает метаболическое включение «тяжелых» C- или N-меченых аминокислот в белки с последующим анализом MS. SILAC требует выращивания клеток в специализированных средах с добавлением легких или тяжелых форм незаменимых аминокислот, лизина или аргинина. Одну популяцию клеток выращивают в среде, содержащей легкие аминокислоты, в то время как экспериментальные условия выращивают в присутствии тяжелых аминокислот. Тяжелые и легкие аминокислоты включаются в белки посредством синтеза клеточного белка. После лизиса клеток равные количества белка из обоих условий объединяют и подвергают протеотипическому расщеплению. Были выбраны аминокислоты аргинин и лизин, потому что трипсин, преобладающий фермент, используемый для создания протеотипических пептидов для анализа MS, расщепляет на С-конце лизина и аргинина. После расщепления трипсином все триптические пептиды из клеток, выращенных в среде SILAC, будут иметь по крайней мере одну меченую аминокислоту, что приведет к постоянному сдвигу массы от меченого образца к немеченому. Поскольку пептиды, содержащие тяжелые и легкие аминокислоты, химически идентичны, они совместно элюируются во время фракционирования на колонке с обращенной фазой и обнаруживаются одновременно во время анализа MS. Относительное содержание белка определяется относительной интенсивностью пиков изотопно различных пептидов.

Традиционно уровень мультиплексирования в SILAC был ограничен из-за количества доступных изотопов SILAC. Недавно появилась новая техника под названием NeuCode SILAC,[14] увеличил уровень мультиплексирования, достигаемый с помощью метаболической маркировки (до 4). Аминокислотный метод NeuCode похож на SILAC, но отличается тем, что при маркировке используются только тяжелые аминокислоты. Использование только тяжелых аминокислот устраняет необходимость 100% включения аминокислот, необходимых для SILAC. Повышенная способность аминокислот NeuCode к мультиплексированию обусловлена ​​использованием дефектов массы от дополнительных нейтронов в стабильных изотопах. Однако эти небольшие различия в массе необходимо разрешить с помощью масс-спектрометров высокого разрешения.

Одним из основных преимуществ SILAC является низкий уровень количественной погрешности из-за ошибок обработки, поскольку тяжелые и легкие образцы объединяются перед подготовкой образцов для анализа МС. SILAC и NeuCode SILAC - отличные методы для обнаружения небольших изменений в уровнях белка или посттрансляционных модификаций между экспериментальными группами.

Изобарическая маркировка

Изобарические массовые метки (тандемные массовые метки) представляют собой метки, которые имеют идентичные массовые и химические свойства, которые позволяют тяжелым и легким изотопологам совместно элюироваться вместе. Все массовые теги состоят из массового репортера, имеющего уникальный номер 13Замены C, нормализатор массы, который имеет уникальную массу, которая уравновешивает массу тега, чтобы сделать все теги равными по массе, и реактивный фрагмент, который перекрестно связывается с пептидами. Эти теги предназначены для расщепления в определенной области линкера при высокоэнергетическом CID, в результате чего получают теги разного размера, которые затем количественно оцениваются с помощью LC-MS / MS. Образцы белков или пептидов, полученные из клеток, тканей или биологических жидкостей, маркируют параллельно с изобарическими масс-метками и объединяют для анализа. Количественное определение белка выполняется путем сравнения интенсивностей репортерных ионов в спектрах МС / МС. Доступны три типа тандемных меток массы с разной реакционной способностью: (1) реактивный эфир NHS, который обеспечивает высокоэффективное амино-специфическое мечение (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex и TMT11plex), (2) реактивная йодацетильная функциональная группа, которая маркирует сульфгидрил- ( -SH) группы (iodoTMT) и (3) реакционноспособная алкоксиаминовая функциональная группа, которая обеспечивает ковалентное мечение карбонилсодержащих соединений (aminoxyTMT).

Ключевым преимуществом изобарической маркировки по сравнению с другими методами количественной оценки (например, SILAC, ICAT, без метки) являются расширенные возможности мультиплексирования и, следовательно, повышенная пропускная способность. Возможность комбинировать и анализировать несколько образцов одновременно в одном цикле ЖХ-МС устраняет необходимость анализа нескольких наборов данных и устраняет вариации от цикла к циклу. Мультиплексирование снижает вариабельность обработки образцов, повышает специфичность за счет одновременного количественного определения белков в каждом состоянии и сокращает время обработки нескольких образцов. Доступные в настоящее время изобарические химические метки позволяют проводить одновременный анализ до 11 экспериментальных образцов.

Количественное определение без метки в масс-спектрометрии

Один из подходов к относительному количественному определению состоит в том, чтобы отдельно проанализировать образцы с помощью МС и сравнить спектры для определения содержания пептидов в одном образце относительно другого, как в без этикеток стратегии. Принято считать, что, хотя количественная оценка без маркировки является наименее точной из парадигм количественной оценки, она также является недорогой и надежной, если подвергнуть ее тщательной статистической проверке. Существует два различных метода количественной оценки в безметочной количественной протеомике: AUC (площадь под кривой) и спектральный подсчет.

Методы количественной оценки без этикеток

AUC - это метод, с помощью которого для заданного спектра пептидов в ходе ЖХ-МС вычисляется площадь под спектральным пиком. Измерения пика AUC линейно пропорциональны концентрации белка в данной смеси аналитов. Количественная оценка достигается с помощью подсчета ионов, измерения количества иона при определенном времени удерживания.[15] Осмотрительность требуется для стандартизации необработанных данных.[16] Спектрометр высокого разрешения может облегчить проблемы, возникающие при попытке сделать данные воспроизводимыми, однако большая часть работы по нормализации данных может выполняться с помощью такого программного обеспечения, как OpenMS и MassView.[17]

Спектральный подсчет включает подсчет спектров идентифицированного белка и затем стандартизацию с использованием некоторой формы нормализации.[18] Обычно это делается с помощью обильного массового отбора пептидов (МС), который затем фрагментируется, а затем подсчитываются спектры МС / МС.[15] Для точной оценки содержания белка требуется несколько отборов пика белка из-за сложной физико-химической природы пептидов. Таким образом, оптимизация для экспериментов MS / MS является постоянной проблемой. Одна из альтернатив для решения этой проблемы - использование независимой от данных техники, которая циклически переключается между высокой и низкой энергией столкновения. Таким образом собирается большой обзор всех возможных ионов-предшественников и продуктов. Однако это ограничено способностью программного обеспечения масс-спектрометрии распознавать и сопоставлять пептидные модели ассоциаций между ионами-предшественниками и продуктами.

Приложения

Рабочий процесс количественной оценки физиологических различий в α- и β-клетках у мышей с использованием компьютерного прогнозирования (A) и количественного определения изотопной метки SILAC (B). (C) - список кандидатов киназ, которые указывают на физиологические различия в α- и β-клетках.[19]

Биомедицинские приложения

Количественная протеомика имеет различные применения в области медицины. Особенно в области открытия лекарств и биомаркеров. Методы ЖХ-МС / МС начали преобладать над более традиционными методами, такими как вестерн-блоттинг и ИФА, из-за громоздкости мечения различных и разделения белков с использованием этих методов и более глобального анализа количественной оценки белков. Методы масс-спектрометрии более чувствительны к различиям в структуре белков, например к посттрансляционной модификации, и, таким образом, могут количественно определять различные модификации белков. Количественная протеомика может обойти эти проблемы, требуя только информации о последовательности. Однако следует учитывать недостатки, связанные с чувствительностью и временем анализа.[20]

Открытие наркотиков

Количественная протеомика имеет наибольшее применение в идентификации белковой мишени, валидации белковой мишени и профилировании токсичности открытие лекарств.[21] Открытие лекарств использовалось для исследования взаимодействия белок-белок, а в последнее время - взаимодействия лекарств с небольшими молекулами. Таким образом, это показало большие перспективы в мониторинге побочных эффектов небольших лекарственных молекул и понимании эффективности и терапевтического эффекта одного лекарственного средства по сравнению с другим.[22][23] Одной из наиболее типичных методологий абсолютного количественного определения белка при открытии лекарств является использование ЖХ-МС / МС с мониторинг множественных реакций (MRM). Масс-спектрометрия обычно выполняется тройной квадрупольный МС.[21]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Онг С.Е., Манн М. (октябрь 2005 г.). «Протеомика на основе масс-спектрометрии становится количественной». Природа Химическая Биология. 1 (5): 252–62. Дои:10.1038 / nchembio736. PMID  16408053. S2CID  32054251.
  2. ^ Баншефф М., Ширле М., Свитмен Дж., Рик Дж., Кустер Б. (октябрь 2007 г.). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: критический обзор». Аналитическая и биоаналитическая химия. 389 (4): 1017–31. Дои:10.1007 / s00216-007-1486-6. PMID  17668192.
  3. ^ а б Николов М, Шмидт С, Урлауб Х (2012). «Количественная протеомика на основе масс-спектрометрии: обзор». Количественные методы в протеомике. Методы молекулярной биологии. 893. С. 85–100. Дои:10.1007/978-1-61779-885-6_7. HDL:11858 / 00-001M-0000-000F-C327-D. ISBN  978-1-61779-884-9. PMID  22665296.
  4. ^ Нинфа, Баллоу, Бенор. Фундаментальные подходы к биохимии и биотехнологии, 2-е издание, 2010 г., Fitzgerald Science Press, Bethesda, MD.
  5. ^ Whitaker JR, Granum PE (ноябрь 1980 г.). «Абсолютный метод определения белка, основанный на разнице оптической плотности при 235 и 280 нм». Аналитическая биохимия. 109 (1): 156–9. Дои:10.1016 / 0003-2697 (80) 90024-х. PMID  7469012.
  6. ^ Энггольм-Келлер К., Ларсен М.Р. (март 2013 г.). «Технологии и проблемы крупномасштабной фосфопротеомики». Протеомика. 13 (6): 910–31. Дои:10.1002 / pmic.201200484. PMID  23404676. S2CID  11166402.
  7. ^ а б Эберсолд Р., Манн М. (сентябрь 2016 г.). «Масс-спектрометрическое исследование структуры и функции протеома». Природа. 537 (7620): 347–55. Bibcode:2016Натура.537..347A. Дои:10.1038 / природа19949. PMID  27629641. S2CID  4448087.
  8. ^ Шпехт Х., Эммотт Э., Петельски А., Хаффман Р.Г., Перлман Д.Х., Серра М., Харченко П., Коллер А., Славов Н. (2019-06-09). «Одноклеточная масс-спектрометрия количественно определяет возникновение неоднородности макрофагов». Дои:10.1101/665307. S2CID  195403321. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  9. ^ Славов Н (июнь 2020). «Одноклеточный анализ белков с помощью масс-спектрометрии». Современное мнение в области химической биологии. 60: 1–9. arXiv:2004.02069. Дои:10.1016 / j.cbpa.2020.04.018. PMID  32599342. S2CID  219966629.
  10. ^ Ода Ю., Хуанг К., Cross FR, Cowburn D, Chait BT (июнь 1999 г.). «Точное количественное определение экспрессии белка и сайт-специфического фосфорилирования». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96 (12): 6591–6. Bibcode:1999PNAS ... 96.6591O. Дои:10.1073 / pnas.96.12.6591. ЧВК  21959. PMID  10359756.
  11. ^ Славов Н (январь 2020 г.). «Открытие протеома в отдельных клетках». Наука. 367 (6477): 512–513. Bibcode:2020Sci ... 367..512S. Дои:10.1126 / science.aaz6695. ЧВК  7029782. PMID  32001644.
  12. ^ Пешкин Л., Рязанова Л., Вур М. и др. (2017). «Байесовские доверительные интервалы для мультиплексной протеомики объединяют ионную статистику с соответствием количественной оценки пептидов». bioRxiv  10.1101/210476.
  13. ^ Пракаш А., Пиенинг Б., Уайтакер Дж., Чжан Х., Шаффер С.А., Мартин Д. и др. (Октябрь 2007 г.). «Оценка систематической ошибки в дизайне экспериментов для крупномасштабной количественной протеомики на основе масс-спектрометрии». Молекулярная и клеточная протеомика. 6 (10): 1741–8. Дои:10.1074 / mcp.M600470-MCP200. PMID  17617667.
  14. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC и др. (Сентябрь 2014 г.). «Этикетки NeuCode для относительного количественного определения белка». Молекулярная и клеточная протеомика. 13 (9): 2503–12. Дои:10.1074 / mcp.M114.040287. ЧВК  4159665. PMID  24938287.
  15. ^ а б Нилсон К.А., Али Н.А., Муралидхаран С., Мирзаи М., Мариани М., Ассадуриан Г. и др. (Февраль 2011 г.). «Меньше этикеток, больше свободы: подходы к безметочной количественной масс-спектрометрии». Протеомика. 11 (4): 535–53. Дои:10.1002 / pmic.201000553. PMID  21243637. S2CID  34809291.
  16. ^ Америка AH, Кордевенер JH (февраль 2008 г.). «Сравнительный ЖХ-МС: пейзаж пиков и впадин». Протеомика. 8 (4): 731–49. Дои:10.1002 / pmic.200700694. PMID  18297651. S2CID  13022870.
  17. ^ Ван В., Чжоу Х., Линь Х., Рой С., Шалер Т.А., Хилл Л.Р. и др. (Сентябрь 2003 г.). «Количественное определение белков и метаболитов масс-спектрометрией без изотопного мечения или добавленных стандартов». Аналитическая химия. 75 (18): 4818–26. Дои:10.1021 / ac026468x. PMID  14674459.
  18. ^ Лундгрен Д.Х., Хван С.И., Ву Л., Хан Д.К. (февраль 2010 г.). «Роль спектрального счета в количественной протеомике». Экспертный обзор протеомики. 7 (1): 39–53. Дои:10.1586 / epr.09.69. PMID  20121475. S2CID  29355269.
  19. ^ Чоудхари А., Ху Хе К., Мертинс П., Удеши Н.Д., Данчик В., Фомина-Ядлин Д. и др. (2014-04-23). «Количественно-протеомное сравнение альфа- и бета-клеток для выявления новых мишеней для перепрограммирования клонов». PLOS ONE. 9 (4): e95194. Bibcode:2014PLoSO ... 995194C. Дои:10.1371 / journal.pone.0095194. ЧВК  3997365. PMID  24759943.
  20. ^ Банчефф М., Лемеер С., Савицкий М.М., Кустер Б. (сентябрь 2012 г.). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: обновление критического обзора с 2007 г. по настоящее время». Аналитическая и биоаналитическая химия. 404 (4): 939–65. Дои:10.1007 / s00216-012-6203-4. PMID  22772140. S2CID  21085313.
  21. ^ а б Оцуки С., Учида Ю., Кубо Ю., Терасаки Т. (сентябрь 2011 г.). «Количественное целевое исследование ADME на основе абсолютной протеомики как новый путь к открытию и разработке лекарств: методология, преимущества, стратегия и перспективы». Журнал фармацевтических наук. 100 (9): 3547–59. Дои:10.1002 / jps.22612. PMID  21560129.
  22. ^ Rix U, Superti-Furga G (сентябрь 2009 г.). «Целевое профилирование малых молекул с помощью химической протеомики». Природа Химическая Биология. 5 (9): 616–24. Дои:10.1038 / nchembio.216. PMID  19690537.
  23. ^ Шеноне М., Данчик В., Вагнер Б.К., Клемонс П.А. (апрель 2013 г.). «Идентификация цели и механизм действия в химической биологии и открытии лекарств». Природа Химическая Биология. 9 (4): 232–40. Дои:10.1038 / nchembio.1199. ЧВК  5543995. PMID  23508189.