Двумерный гель-электрофорез - Two-dimensional gel electrophoresis

2D-гели (окрашенные кумасси)
Роботы используются для выделения белковых пятен из 2D-гелей в современных лабораториях.

Двумерный гель-электрофорез, сокращенно 2-DE или 2-D электрофорез, это форма гель-электрофорез обычно используется для анализа белки. Смеси белков разделены двумя свойствами в двух измерениях на 2D-гелях. 2-DE был впервые независимо введен О'Фаррелл[1] и Клозе[2] в 1975 г.

Основание для разделения

2-D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем отделяет молекулы перпендикулярно от первого, чтобы создать электрофореграмма во втором измерении. При электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Во втором измерении молекулы затем разделяются под углом 90 градусов от первой электрофореграммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут похожи по двум различным свойствам, молекулы более эффективно разделяются в 2-D электрофорезе, чем в 1-D электрофорезе.

Два измерения, на которые разделяются белки с помощью этого метода, могут быть изоэлектрическая точка, белковая комплексная масса в родные состояние, или белок масса.

Разделение белков по изоэлектрической точке называется изоэлектрическая фокусировка (IEF). Таким образом, к гелю применяется градиент pH, и к гелю прикладывается электрический потенциал, что делает один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, кроме их изоэлектрической точки, белки будут заряжаться. Если они заряжены положительно, они будут притягиваться к более отрицательному концу геля, а если они заряжены отрицательно, они будут притянуты к более положительному концу геля. Белки, нанесенные в первом измерении, будут двигаться вдоль геля и накапливаться в своей изоэлектрической точке; то есть точка, в которой общий заряд белка равен 0 (нейтральный заряд).

Для анализа функционирования белков в ячейка, знание их сотрудничества имеет важное значение. Чаще всего белки действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этого суб органелла организация клетки требует методов, сохраняющих естественное состояние белковые комплексы. При электрофорезе в нативном полиакриламидном геле (родная страница ), белки остаются в своем естественном состоянии и разделяются в электрическом поле в соответствии с их массой и массой их комплексов. Чтобы получить разделение по размеру, а не по чистому заряду, как в IEF, дополнительный заряд переносится на белки за счет использования Кумасси бриллиантовый синий или додецилсульфат лития. После завершения первого измерения комплексы разрушаются путем применения денатурирующего SDS-PAGE во втором измерении, где белки, из которых состоят комплексы, разделяются по своей массе.

Перед разделением белков по массе их обрабатывают додецилсульфат натрия (SDS) вместе с другими реагентами (SDS-СТРАНИЦА в 1-D). Это денатурирует белки (то есть разворачивает их в длинные прямые молекулы) и связывает ряд молекул SDS, примерно пропорциональных длине белка. Поскольку длина белка (в развернутом виде) примерно пропорциональна его массе, это эквивалентно тому, что он присоединяет количество молекул SDS, примерно пропорциональное массе белка. Поскольку молекулы SDS заряжены отрицательно, в результате все белки будут иметь примерно одинаковое соотношение массы к заряду. Кроме того, белки не будут мигрировать, когда у них нет заряда (в результате этапа изоэлектрического фокусирования), поэтому покрытие белка в SDS (отрицательно заряженном) позволяет переносить белки во втором измерении (SDS-PAGE, это не совместим для использования в первом измерении, поскольку он заряжен, и необходимо использовать неионогенное или цвиттерионное моющее средство). Во втором измерении снова прикладывается электрический потенциал, но под углом 90 градусов от первого поля. Белки будут притягиваться к более положительной стороне геля (потому что SDS заряжен отрицательно) пропорционально их соотношению массы к заряду. Как объяснялось ранее, это соотношение будет почти одинаковым для всех белков. Продвижение белков будет замедляться силами трения. Таким образом, гель действует как молекулярное сито при приложении тока, разделяя белки на основе их молекулярной массы, при этом более крупные белки удерживаются выше в геле, а более мелкие белки могут проходить через сито и достигать нижних областей геля. .

Обнаружение белков

В результате получается гель с распределенными по поверхности белками. Эти белки затем могут быть обнаружены различными способами, но чаще всего используются красители. серебро и Кумасси бриллиантовый синий окрашивание. В первом случае на гель наносится коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами в белке. Серебро темнеет под воздействием ультрафиолетового света. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, с количеством белка в данном месте на геле. Это измерение может дать только приблизительные суммы, но подходит для большинства целей. Окрашивание серебром в 100 раз чувствительнее, чем Кумасси бриллиантовый синий с 40-кратным диапазоном линейности.[3]

Молекулы, отличные от белков, можно разделить с помощью 2D-электрофореза. В суперспирализация пробы, спиральные ДНК разделяется в первом измерении и денатурируется интеркалятором ДНК (например, этидиум бромид или менее канцерогенный хлорохин ) В секунду. Это сопоставимо с комбинацией нативного PAGE / SDS-PAGE при разделении белков.

Общие техники

IPG-DALT

Распространенной техникой является использование Иммобилизованный градиент pH (IPG) в первом измерении. Этот метод упоминается как IPG-DALT. Образец сначала разделяют на гель IPG (который имеется в продаже), затем гель разрезают на ломтики для каждого образца, который затем уравновешивают в SDS-меркаптоэтаноле и наносят на SDS-СТРАНИЦА гель для разрешения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественного определения белков из-за потери низкомолекулярных компонентов во время переноса в гель SDS-PAGE.[4]

IEF SDS-PAGE

Видеть Изоэлектрическая фокусировка

Программное обеспечение для 2D-анализа гелей

Основная статья: Программное обеспечение для 2D-анализа гелей
Деформация: изображения двух 2D-гелей для электрофореза, наложенные Delta2D. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе - в синий. Из-за различий хода соответствующие точки не перекрываются.
Деформация: изображения двух гелей для 2D-электрофореза после деформации. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе - в синий. Соответствующие пятна перекрываются после деформации. Обычные пятна окрашены в черный цвет, оранжевые пятна присутствуют (или намного сильнее) только на первом изображении, синие пятна присутствуют (или намного сильнее) на втором изображении.

В количественная протеомика эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественной оценки отдельных белков и отображения разделения между одним или несколькими белковыми «пятнами» на сканированном изображении геля 2-DE. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями схожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранней и поздней стадиями заболевания. Пакеты программного обеспечения включают, среди прочего, Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, Progenesis и REDFIN.[нужна цитата ] Хотя эта технология широко используется, интеллект еще не усовершенствован. Например, хотя PDQuest и Progenesis имеют тенденцию согласовывать количественную оценку и анализ четко определенных четко разделенных белковых пятен, они дают разные результаты и тенденции анализа с менее выраженными, менее разделенными пятнами.[5]

Проблемы автоматического программного анализа включают не полностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные и / или разделенные), слабые места / шум (например, «пятна-призраки»), различия между гелями (например, белок мигрирует в разные положения на разные гели), непревзойденные / необнаруженные пятна, приводящие к недостающие значения,[6][7] несовпадающие пятна, ошибки в количественной оценке (несколько отдельных точек могут быть ошибочно обнаружены программным обеспечением как единое пятно и / или части пятна могут быть исключены из количественной оценки), а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, тенденции анализа

Сгенерированные списки комплектации могут использоваться для автоматизированного переваривание в геле белковых пятен, и последующая идентификация белков масс-спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ может идентифицировать точные измерения массы наряду с секвенированием пептидов в диапазоне от 1000 до 4000 атомных единиц массы. [8]Для обзора текущего подхода к программному анализу изображений гелей 2DE см.[9] или же.[10]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ О'Фаррелл, PH (1975). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения». J. Biol. Chem. 250 (10): 4007–21. ЧВК  2874754. PMID  236308.
  2. ^ Клозе, Дж (1975). «Картирование белков путем комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих». Humangenetik. 26 (3): 231–43. Дои:10.1007 / bf00281458 (неактивно 09.11.2020). PMID  1093965.CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2020 г. (ссылка на сайт)
  3. ^ Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (1979). «Высокочувствительный серебряный краситель для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия. 98 (1): 231–37. Дои:10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID  94518.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  4. ^ Миккельсен, Сьюзен; Кортон, Эдуардо (2004). Биоаналитическая химия. John Wiley & Sons, Inc. стр.224. ISBN  978-0-471-62386-1.
  5. ^ Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). «Сравнительная оценка двух программных приложений для анализа изображений двумерного гель-электрофореза с использованием синовиальной жидкости пациентов с заболеваниями суставов». J Orthop Sci. 10 (2): 160–66. Дои:10.1007 / s00776-004-0878-0. PMID  15815863. S2CID  45193214.
  6. ^ Педрески Р., Хертог М.Л., Карпентье С.К. и др. (Апрель 2008 г.). «Обработка пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика. 8 (7): 1371–83. Дои:10.1002 / pmic.200700975. HDL:1942/8262. PMID  18383008. S2CID  21152053.
  7. ^ Какие значения отсутствуют и почему они являются проблемой?
  8. ^ Лепедда, Антонио Дж. И Марилена Формато. «Применение технологии двумерного электрофореза для изучения атеросклероза». EJIFCC vol. 19,3 146-59. 20 декабря 2008 г.
  9. ^ Причал М, Мозер Ф.М., Кольбе М, Бернхардт Дж. (Октябрь 2007 г.). «Современное состояние анализа двумерных изображений гель-электрофореза». Appl. Microbiol. Биотехнология. 76 (6): 1223–43. Дои:10.1007 / s00253-007-1128-0. ЧВК  2279157. PMID  17713763.
  10. ^ Бандоу Дж. Э., Бейкер Дж. Д., Берт М. и др. (Август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для 2-D гелей позволяет проводить крупномасштабные исследования протеомики на основе 2-D гелей - исследование открытия биомаркеров ХОБЛ». Протеомика. 8 (15): 3030–41. Дои:10.1002 / pmic.200701184. PMID  18618493. S2CID  206361897.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы около
Двумерный гель-электрофорез