RESOLFT - RESOLFT

RESOLFT, сокращение от REуниверсальный Sневыносимый ОптикаL Fсвечение Тransitions, обозначает группу методов оптической флуоресцентной микроскопии с очень высоким разрешением. Используя стандартные дальнее поле оптика видимого света разрешение далеко ниже дифракционного предела вплоть до молекулярных масштабов.

С обычным микроскопия методов невозможно различить объекты, расположенные на расстоянии менее половины длина волны (т.е. около 200 нм для видимый свет ). Этот предел дифракции основан на волновой природе свет. В обычных микроскопах предел определяется используемой длиной волны и числовая апертура оптической системы. Концепция RESOLFT преодолевает этот предел, временно переключая молекулы в состояние, в котором они не могут посылать (флуоресцентный) сигнал при освещении. Эта концепция отличается от, например, электронная микроскопия где вместо этого используемая длина волны намного меньше.

Принцип работы

RESOLFT микроскопия - это оптическая микроскопия с очень высоким разрешением, позволяющим отображать детали в образцах, которые невозможно отобразить с помощью обычных или конфокальная микроскопия. В рамках RESOLFT принципы STED-микроскопия ^[1][2] и GSD микроскопия обобщены. Структуры, которые обычно слишком близки друг к другу, чтобы их можно было различить, считываются последовательно.

В рамках этой структуры могут быть объяснены все методы, которые работают с молекулами, которые имеют по крайней мере два различимых состояния, где возможно обратимое переключение между двумя состояниями и где по крайней мере один такой переход может быть индуцирован оптически.

В большинстве случаев используются флуоресцентные маркеры, где одно состояние (A) является ярким, то есть генерирует сигнал флуоресценции, а другое состояние (B) является темным и не дает сигнала. Один переход между ними может быть вызван светом (например, A → B, от яркого к темному).

Образец освещается неоднородно, при этом интенсивность освещения в одном положении очень мала (ноль в идеальных условиях). Только в этом месте молекулы никогда не находятся в темном состоянии B (если A - это ранее существовавшее состояние) и остаются полностью в ярком состоянии A. Область, где молекулы в основном находятся в ярком состоянии, можно сделать очень маленькой (меньше чем обычный дифракционный предел) за счет увеличения интенсивности переходного света (см. ниже). Таким образом, известно, что любой обнаруженный сигнал исходит только от молекул в небольшой области вокруг минимума интенсивности освещения. Изображение с высоким разрешением может быть построено путем сканирования образца, т. Е. Смещения профиля освещения по поверхности.^[3]

Обратный переход от B к A может быть спонтанным или вызванным светом другой длины волны. Молекулы должны переключаться несколько раз, чтобы находиться в состоянии A или B в разное время во время сканирования образца. Этот метод также работает, если поменять местами светлое и темное состояние, тогда получается негативное изображение.

Разрешение ниже дифракционного предела

Принцип RESOLFT: образец неоднородно освещен (красная линия). Интенсивность уменьшается в области, сопоставимой с классическим пределом разрешения, но (в идеале) равна нулю только в одной позиции. Пороговая интенсивность (синяя линия), необходимая для переключения молекул в темное состояние, составляет лишь часть максимальной приложенной интенсивности, поэтому только молекулы, очень близкие к положению минимальной интенсивности, могут находиться в ярком состоянии. Зеленая область в правом кадре показывает размер области, в которой молекулы могут генерировать сигнал.

В RESOLFT область, где молекулы находятся в состоянии A (яркое состояние), можно сделать сколь угодно малой, несмотря на дифракционный предел.

• Образец необходимо освещать неоднородно, чтобы создать изолированную точку нулевой интенсивности. Это может быть достигнуто, например, вмешательством.
• При низкой интенсивности (ниже синей линии на изображении) большинство молекул маркеров находятся в ярком состоянии, если интенсивность выше, большинство маркеров находятся в темном состоянии.

При слабом освещении мы видим, что область, где молекулы остаются в состоянии A, все еще довольно велика, потому что освещение настолько низкое, что большинство молекул находится в состоянии A. Форму профиля освещения не нужно изменять. Увеличение яркости освещения уже приводит к уменьшению площади, где интенсивность ниже величины для эффективного переключения в темное состояние. Следовательно, также уменьшается область, где молекулы могут находиться в состоянии A. Сигнал (флуоресценции) во время последующего считывания исходит из очень маленького пятна, и можно получить очень четкие изображения.

В концепции RESOLFT разрешение можно приблизительно определить как ${displaystyle Delta dsimeq {frac {lambda }{pi n{sqrt {frac {I}{Isat}}}}}}$, Посредством чего ${displaystyle I_{sat}}$ - характерная интенсивность, необходимая для насыщения перехода (половина молекул остается в состоянии A, а половина - в состоянии B), и ${displaystyle I}$ обозначает применяемую интенсивность. Если минимумы создаются фокусирующей оптикой с числовой апертурой ${displaystyle {mbox{NA}}=nsin alpha }$, минимальное расстояние, на котором можно различить два одинаковых объекта, равно ${displaystyle Delta d={frac {lambda }{2ncdot sin alpha cdot {sqrt {1+{frac {I}{Isat}}}}}}}$ что можно рассматривать как продолжение Аббат Уравнение. Безграничность дифракции в семействе концепций RESOLFT отражается в том факте, что минимальное разрешаемое расстояние ${displaystyle Delta d}$ можно непрерывно уменьшать, увеличивая ${displaystyle varsigma ={frac {I}{Isat}}}$. Следовательно, поиск наноразмерного разрешения сводится к максимальному увеличению этого количества. Это возможно за счет увеличения ${displaystyle I}$ или понижая ${displaystyle I_{sat}}$.

Варианты

При переключении молекулярных состояний используются разные процессы. Однако все они имеют общее, что используются по крайней мере два различимых состояния. Обычно используемое свойство флуоресценции отмечает различие состояний, однако это не является существенным, поскольку также могут использоваться свойства поглощения или рассеяния.^[4]

STED Микроскопия

(Основная статья STED-микроскопия )

В рамках STED-микроскопии (STimulated Emission Depletion микроскопия)^[1][2] молекула флуоресцентного красителя движется между своим основным электронным состоянием и возбужденным состоянием, при этом испуская фотоны флуоресценции. Это стандартный режим работы флуоресцентной микроскопии, отображающий состояние A. В состоянии B краситель постоянно поддерживается в своем основном электронном состоянии посредством стимулированное излучение. Если краситель может флуоресцировать в состоянии A, но не в состоянии B, применяется концепция RESOLFT.

GSD микроскопия

(Основная статья GSD микроскопия )

GSD-микроскопия (микроскопия истощения основного состояния) также использует флуоресцентные маркеры. В состоянии A молекула может свободно перемещаться между основным и первым возбужденным состоянием и может излучаться флуоресценция. В темном состоянии B основное состояние молекулы опустошается, происходит переход в долгоживущее возбужденное состояние, из которого флуоресценция не испускается. Пока молекула находится в темном состоянии, она недоступна для переключения между основным и возбужденным состояниями, поэтому флуоресценция отключается.

СПЭМ и SSIM

SPEM (микроскопия возбуждения с насыщенной структурой)^[5] и SSIM (микроскопия с насыщенным структурированным освещением)^[6] используют концепцию RESOLFT с использованием насыщенного возбуждения для создания «негативных» изображений, то есть флуоресценция возникает отовсюду, кроме очень небольшой области вокруг геометрического фокуса микроскопа. Также для освещения используются неточечные узоры. Чтобы снова получить позитивные изображения, необходима математическая реконструкция изображения.

RESOLFT с переключаемыми белками

Немного флуоресцентные белки может включаться и выключаться светом соответствующей длины волны. Их можно использовать в микроскопе типа RESOLFT.^[7]При освещении светом эти белки меняют свою конформацию. В процессе они приобретают или теряют способность излучать флуоресценцию. Состояние флуоресценции соответствует состоянию A, состояние отсутствия флуоресценции - состоянию B, и снова применяется концепция RESOLFT. Обратимый переход (например, от B обратно к A) происходит либо спонтанно, либо снова под действием света. Индуцирование конформационных изменений в белках может быть достигнуто уже при гораздо более низких интенсивностях переключаемого света по сравнению со стимулированным излучением или истощением основного состояния (несколько Вт / см²). В комбинации с 4Pi микроскопия изображения живых клеток с изотропным разрешением ниже 40 нм были получены при слабом освещении.^[8]

RESOLFT с переключаемыми органическими красителями

Как и в случае с белками, некоторые органические красители могут изменять свою структуру при освещении.^[9][10] Способность таких органических красителей к флуоресценции можно включать и выключать с помощью видимого света. И снова применяемая сила света может быть довольно низкой (около 100 Вт / см²).

Рекомендации

1. Стефан В. Ад и Ян Вихманн (1994). «Преодоление предела дифракционного разрешения с помощью стимулированного излучения: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированного излучения». Письма об оптике. 19 (11): 780–2. Bibcode:1994OptL ... 19..780H. Дои:10.1364 / OL.19.000780. PMID  19844443.
2. Томас А. Клар; Стефан В. Ад (1999). «Субдифракционное разрешение в флуоресцентной микроскопии дальнего поля». Письма об оптике. 24 (14): 954–956. Bibcode:1999OptL ... 24..954K. Дои:10.1364 / OL.24.000954. PMID  18073907.
3. Смотрите также Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
4. Стефан В. Ад (2004). «Стратегия создания оптических изображений и записи в дальней зоне без дифракционного предела». Письма о физике A. 326 (1–2): 140–145. Bibcode:2004ФЛА..326..140Х. Дои:10.1016 / j.physleta.2004.03.082.
5. Райнер Хайнцманн; Томас М. Джовин; Кристоф Кремер (2002). «Насыщенная узорчатая микроскопия возбуждения - концепция улучшения оптического разрешения». Журнал Оптического общества Америки A. 19 (8): 15991609. Bibcode:2002JOSAA..19.1599H. Дои:10.1364 / JOSAA.19.001599. HDL:11858 / 00-001M-0000-0029-2C24-9.
6. Матс Г. Л. Густафссон (2005). «Нелинейная микроскопия со структурированным освещением: широкопольная флуоресцентная визуализация с теоретически неограниченным разрешением». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (37): 13081–6. Bibcode:2005PNAS..10213081G. Дои:10.1073 / pnas.0406877102. ЧВК  1201569. PMID  16141335.
7. Майкл Хофманн; Кристиан Эггелинг; Стефан Якобс; Стефан В. Ад (2005). «Нарушение дифракционного барьера в флуоресцентной микроскопии при низкой интенсивности света за счет использования обратимых фотосопереключаемых белков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (49): 17565–9. Bibcode:2005PNAS..10217565H. Дои:10.1073 / pnas.0506010102. ЧВК  1308899. PMID  16314572.
8. Ульрике Бём; Стефан В. Ад; Роман Шмидт (2016). «Наноскопия 4Pi-RESOLFT». Nature Communications. 7 (10504): 1–8. Bibcode:2016НатКо ... 710504B. Дои:10.1038 / ncomms10504. ЧВК  4740410. PMID  26833381.
9. Мариано Босси; Йонас Фёллинг; Маркус Дайба; Фолькер Вестфаль; Стефан В. Ад (2006). «Нарушение дифракционного барьера разрешающей способности в микроскопии дальнего поля за счет молекулярной оптической бистабильности». Новый журнал физики. 8 (11): 275. Bibcode:2006NJPh .... 8..275B. Дои:10.1088/1367-2630/8/11/275.
10. Дживун Квон; Джихи Хван; Jaewan Park; Ги Рим Хан; Кю Ён Хан; Сон Гын Ким (2015). «Наноскопия RESOLFT с фотопереключаемыми органическими флуорофорами». Научные отчеты. 5: 17804. Bibcode:2015НатСР ... 517804K. Дои:10.1038 / srep17804. ЧВК  4671063. PMID  26639557.