Изотермическая амплификация, опосредованная обратной транскрипцией - Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification

Схема амплификации RT-LAMP, на примере SARS-CoV-2 обнаружение.

Изотермическая амплификация, опосредованная обратной транскрипцией (РТ-ЛАМПА) представляет собой одностадийный метод амплификации нуклеиновых кислот для умножения определенных последовательностей РНК. Он используется для диагностики инфекционного заболевания, вызываемого РНК-вирусами.[1]

Он сочетает в себе ЛАМПА[2] ДНК-обнаружение с помощью обратная транскрипция, делая кДНК от РНК перед запуском реакции.[3] RT-LAMP не требует тепловые циклы (в отличие ПЦР ) и выполняется при постоянной температуре от 60 до 65 ° C.

RT-LAMP используется для обнаружения РНК-вирусы (Группы II, IV и V на Классификация вирусов Балтимора система), например Вирус SARS-CoV-2[4][5] и Вирус Эбола [6]

Приложения

RT-LAMP используется для проверки наличия специфических образцов РНК вирусов для конкретной последовательности вируса, что стало возможным благодаря сравнению последовательностей с большой внешней базой данных ссылок.

Обнаружение вируса COVID-19

Техника RT-LAMP поддерживается как более дешевая и простая альтернатива ОТ-ПЦР для ранней диагностики людей, инфекционных для COVID-19.[7] Есть открытый доступ тестовые проекты (включая рекомбинантные белки ), что делает возможным проведение теста любым лицом. [4] В отличие от классических экспресс-тестов боковой поток, RT-LAMP позволяет раннюю диагностику заболевания путем тестирования вирусная РНК.[4]

Тесты можно проводить без предварительного выделения РНК, обнаруживая вирусы непосредственно из мазков.[5] или из слюна[4].

Обнаружение нечеловеческих вирусов

Одним из примеров использования RT-LAMP был эксперимент по обнаружению нового утка Тембусу-подобный вирус BYD, названный в честь региона, Байяндянь, где он был впервые выделен[8][9][1]Еще одно недавнее применение этого метода было в эксперименте 2013 года по обнаружению вируса Акабане с использованием RT-LAMP. В ходе эксперимента, проведенного в Китае, вирус был выделен из абортированных плодов телят.[10]

Методология

Обратная транскрипция

Определенная последовательность кДНК обнаруживается 4 LAMP грунтовки. Двое из них внутренние грунтовки (FIP и BIP), которые служат основой для Фермент bst скопируйте шаблон в новую ДНК. В внешние грунтовки(F3 и B3) отжигают на нити шаблона и помогают протекать реакции.

Как и в случае с ОТ-ПЦР, процедура RT-LAMP начинается с создания ДНК из образца РНК. Это преобразование производится обратная транскриптаза, фермент, полученный из ретровирусы способный произвести такое преобразование.[4] Эта ДНК, полученная из РНК, называется кДНК, или комплементарная ДНК. Праймер FIP используется обратная транскриптаза для построения однониточной копии ДНК. Праймер F3 также связывается с этой стороной цепи матрицы и замещает ранее созданную копию.

Усиление

Эта смещенная одноцепочечная копия представляет собой смесь целевой РНК и праймеров. Праймеры предназначены для того, чтобы иметь последовательность, которая связывается с самой последовательностью, образуя петлю.

Праймер BIP связывается с другим концом этой одиночной цепи и используется Bst ДНК-полимераза чтобы построить дополнительную цепь, образуя двухцепочечную ДНК. Праймер F3 связывается с этим концом и снова вытесняет этот вновь образованный одноцепочечная ДНК молекула.

Эта новая отдельная цепь, которая была выпущена, будет действовать как отправная точка для циклической амплификации LAMP. Эта одноцепочечная ДНК имеет гантель -подобная структура, так как концы складываются и самосвязываются, образуя две петли.

ДНК-полимераза и праймеры FIP или BIP продолжают амплифицировать эту цепь, и продукт LAMP-реакции удлиняется. Этот цикл может быть начат как с передней, так и с обратной стороны нити, используя соответствующий праймер. После того, как этот цикл начался, цепь подвергается самопримированному синтезу ДНК во время стадии удлинения процесса амплификации. Это усиление происходит менее чем за час в изотермических условиях от 60 до 65 ° C.

Зачитать

Показания тестов RT-LAMP часто являются колориметрическими. Два распространенных способа основаны на измерении либо pH или магний ионы. Реакция амплификации приводит к снижению pH и снижению уровня Mg2 +. Об этом можно судить по таким индикаторам, как Фенол красный, для pH и гидроксинафтоловый синий (HNB), для магния.[4] Другой вариант - использовать SYBR Зеленый I краситель, интеркалирующий ДНК. [11]

Колориметрическое определение реакций RT-LAMP в Пробирки Эппендорфа.

Преимущества и недостатки

Пример установки RT-LAMP на водяной бане, требующей недорогого оборудования на Венский биоцентр.

Этот метод особенно выгоден тем, что все это можно сделать быстро за один шаг. Образец смешивают с праймерами, обратной транскриптазой и ДНК-полимеразой, и реакция протекает при постоянной температуре. Требуемой температуры можно достичь с помощью простой водяной бани.

ПЦР требует термоциклирование; RT-LAMP не работает, что делает его более эффективным по времени и очень рентабельным.[3] Этот недорогой и оптимизированный метод может быть более использован в развивающихся странах, у которых нет доступа к высокотехнологичным лабораториям.

Недостатком этого метода является создание праймеров, специфичных для последовательности. Для каждого анализа LAMP должны быть специально разработаны праймеры, совместимые с целевой ДНК. Это может быть сложно, что отталкивает исследователей от использования метода LAMP в своей работе.[1] Однако существует бесплатное программное обеспечение под названием Primer Explorer, разработанное Fujitsu в Японии, которое может помочь в выборе этих праймеров.

использованная литература

  1. ^ а б c Мори Ю., Нотоми Т. (2009). «Петлевая изотермическая амплификация (LAMP): быстрый, точный и экономичный метод диагностики инфекционных заболеваний». J. Infect. Chemother. 15 (2): 62–9. Дои:10.1007 / s10156-009-0669-9. ЧВК  7087713. PMID  19396514.
  2. ^ Нотоми, Цугунори; Окаяма, Хирото; Масубучи, Харуми; Ёнекава, Тосихиро; Ватанабэ, Кейко; Амино, Нобуюки; Хасэ, Тецу (2000-06-15). «Петлевая изотермическая амплификация ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 28 (12): e63. Дои:10.1093 / nar / 28.12.e63. ISSN  0305-1048. ЧВК  102748. PMID  10871386.
  3. ^ а б Фу С., Цюй Г., Го С., Ма Л., Чжан Н., Чжан С., Гао С., Шэнь З. (2011). «Применение петлевой изотермической амплификации ДНК». Appl. Biochem. Биотехнология. 163 (7): 845–50. Дои:10.1007 / s12010-010-9088-8. PMID  20844984. S2CID  45682156.
  4. ^ а б c d е ж Келлнер, Макс Дж .; Росс, Джеймс Дж .; Шнабль, Якоб; Dekens, Marcus P. S .; Хайнен, Роберт; Гришковская, Ирина; Бауэр, Бенедикт; Штадльманн, Йоханнес; Менендес-Ариас, Луис; Фриче-Поланц, Роберт; Трауготт, Марианна (23.07.2020). «Быстрый, высокочувствительный и открытый анализ обнаружения SARS-CoV-2 для лабораторных и домашних тестов». bioRxiv: 2020.06.23.166397. Дои:10.1101/2020.06.23.166397. S2CID  220835822.
  5. ^ а б Лалли, Мэтью А .; Лангмад, С. Джошуа; Чен, Сюйхуа; Fronick, Catrina C .; Сойер, Кристофер С .; Burcea, Lauren C .; Уилкинсон, Майкл Н .; Фултон, Роберт С .; Хайнц, Майкл; Buchser, Уильям Дж .; Голова, Ричард Д .; Mitra, Robi D .; Милбрандт, Джеффри (2020). «Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 в слюне без экстракции с помощью колориметрической ЛАМПЫ». MedRxiv. Дои:10.1101/2020.05.07.20093542. ЧВК  7273276. PMID  32511508.
  6. ^ Куросаки, Йохей; Магассуба, Н’Фали; Oloniniyi, Olamide K .; Cherif, Mahamoud S .; Сакабе, Саори; Такада, Аято; Хираяма, Кендзи; Ясуда, Дзиро (22 февраля 2016 г.). «Разработка и оценка метода изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией (RT-LAMP), в сочетании с портативным устройством для быстрой диагностики болезни, вызванной вирусом Эбола, в Гвинее». PLOS забытые тропические болезни. 10 (2): e0004472. Дои:10.1371 / journal.pntd.0004472. ISSN  1935-2735. ЧВК  4764121. PMID  26900929.
  7. ^ «Тест на основе LAMP может сделать возможным тестирование на COVID-19 на месте». Диагностика от технологических сетей. Получено 2020-07-31.
  8. ^ Вайдья Н.К., Ван Ф. Б., Цзоу X, Валь Л. М. (2012). «Динамика передачи недавно идентифицированного вируса BYD, вызывающего синдром утиного яйца». PLOS ONE. 7 (4): e35161. Bibcode:2012PLoSO ... 735161V. Дои:10.1371 / journal.pone.0035161. ЧВК  3329443. PMID  22529985.
  9. ^ Цзян Т., Лю Дж., Дэн YQ, Су JL, Сюй LJ, Лю Чж, Ли XF, Ю XD, Чжу С.Ю., Гао Г.Ф., Цинь ED, Цинь CF (декабрь 2012 г.). «Разработка тестов RT-LAMP и RT-PCR в реальном времени для быстрого обнаружения нового вируса BYD, подобного утиному Тембусу». Arch. Вирол. 157 (12): 2273–80. Дои:10.1007 / s00705-012-1431-7. PMID  22865206. S2CID  15573433.
  10. ^ Цяо Дж, Ван Дж, Мэн Кью, Ван Г, Лю И, Хэ З, Ян Х, Чжан З, Цай Х, Чен С. (2013). «Быстрое обнаружение вируса Акабане с помощью нового метода изотермической амплификации, опосредованного обратной транскрипцией (RT-LAMP)». Virol. J. 10: 288. Дои:10.1186 / 1743-422X-10-288. ЧВК  3848447. PMID  24034624.
  11. ^ Бокельманн, Лукас; Никель, Олаф; Маричич, Томислав; Паабо, Сванте; Мейер, Матиас; Борт, Стефан; Ризенберг, Стефан (06.08.2020). «Быстрое, надежное и дешевое массовое тестирование в месте оказания медицинской помощи на SARS-CoV-2 путем комбинирования гибридизационного захвата с улучшенной колориметрической лампой (Cap-iLAMP)». dx.doi.org. Получено 2020-10-13.

внешние ссылки