STARR-seq - STARR-seq

STARR-seq (Короче для самотранскрибирующееся секвенирование активной регуляторной области) - это метод анализа усилитель активность миллионов кандидатов из произвольных источников ДНК. Он используется для идентификации последовательностей, которые действуют как усилители транскрипции, прямым, количественным и общегеномным образом.[1]

А
Методология STARR-seq

Вступление

В эукариоты, транскрипция регулируется специфичными для последовательности ДНК-связывающими белками (факторы транскрипции ) связанный с геном промоутер а также удаленными контрольными последовательностями, включая энхансеры. Энхансеры - это некодирующие последовательности ДНК, содержащие несколько сайтов связывания для различных факторов транскрипции.[2] Обычно они привлекают транскрипционные факторы, которые модулируют хроматин структуры и напрямую взаимодействуют с аппаратом транскрипции, размещенным на промоторе гена. Энхансеры способны регулировать транскрипцию генов-мишеней в зависимости от типа клетки,[1] независимо от их местоположения или расстояния от промотора генов. Иногда они могут регулировать транскрипцию генов, расположенных в разных хромосома.[3] Однако знания об энхансерах до сих пор ограничивались исследованиями небольшого числа энхансеров, так как их было трудно точно идентифицировать в масштабе всего генома.[2] Более того, многие регуляторные элементы функционируют только в определенных типах клеток и в определенных условиях.[4]

Обнаружение усилителя

Обнаружение усилителя в Дрозофила представляет собой оригинальную методологию, использующую случайную вставку вектора, полученного из транспозона, который кодирует репортерный белок ниже минимального промотора. Этот подход позволяет наблюдать экспрессию репортера в трансгенные животные и предоставляет информацию о близлежащих генах, которые регулируются этими последовательностями. Открытие и характеристика типов клеток вместе с генами, участвующими в их определении, были значительно улучшены с открытием этого метода.[5][6][7][8]

За последние несколько лет постгеномные технологии продемонстрировали специфические особенности сбалансированных и активных энхансеров, которые улучшили обнаружение энхансеров.[2] Разработка новых методов, таких как глубокое секвенирование сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I (ДНКаза-Seq ), секвенирование выделения регуляторных элементов с помощью формальдегида (FAIRE-Seq ) и иммунопреципитации хроматина с последующим глубоким секвенированием (ChIP-секвенирование ) обеспечивают предсказания энхансера на уровне всего генома по характеристикам хроматина, связанным с энхансером.[1]

Заявление

DHS-секвенирование и FAIRE-секвенирование не обеспечивают прямого функционального или количественного считывания активности энхансера. Чтобы получить это, необходимы репортерные анализы, которые определяют силу энхансера из нагрузки репортерных транскриптов. Более того, такие анализы не могут предложить миллионы тестов, необходимых для идентификации энхансеров в масштабе всего генома.[1]Разработка STARR-seq помогает идентифицировать энхансеры прямым, количественным и общегеномным способом. Воспользовавшись знанием того, что энхансеры могут работать независимо от их относительного расположения, последовательности-кандидаты размещаются ниже минимального промотора, что позволяет активным энхансерам транскрибировать себя. Затем сила каждого энхансера отражается в его богатстве среди клеточных РНК. Такое прямое связывание последовательностей-кандидатов с активностью энхансера позволяет проводить параллельную оценку миллионов фрагментов ДНК из произвольных источников.[1]

Методология

Геномная ДНК случайным образом разрезается и разбивается на мелкие фрагменты. Адаптеры лигируют с фрагментами ДНК выбранного размера. Затем фрагменты, связанные адаптером, амплифицируются, и ПЦР Продукты очищают с последующим размещением последовательностей-кандидатов ниже минимального промотора скрининговых векторов, что дает им возможность транскрибировать себя. Затем клетки-кандидаты трансфицируют репортерной библиотекой и культивируют. После этого всего РНК извлекаются и поли-А РНК изолированы. С помощью обратная транскрипция метод кДНК производятся, амплифицируются, а затем фрагменты-кандидаты используются для высокопроизводительной парная последовательность концов. Чтения последовательности сопоставляются с эталонный геном и выполняется вычислительная обработка данных.[1]

Обнаружение энхансеров у дрозофилы

Применяя эту технологию к геному дрозофилы, Arnold et al.[1] обнаружили 96% неповторяющегося генома с по крайней мере 10-кратным покрытием. Авторы обнаружили, что большинство идентифицированных энхансеров (55,6%) были помещены в интроны, особенно в первом интроне и межгенные области. 4,5% энхансеров располагались в сайты начала транскрипции (TSS), предполагая, что эти энхансеры могут запускать транскрипцию, а также улучшать транскрипцию с удаленных TSS.[1] Самые сильные усилители были рядом гены домашнего хозяйства такие как ферменты или компонент цитоскелет и регуляторы развития, такие как факторы транскрипции. Самый сильный энхансер находился внутри интрона фактора транскрипции zfh1. Этот фактор транскрипции регулирует нейропептид экспрессия и рост личиночных нервно-мышечных соединений у Drosophila.[9] В рибосомальный белок гены были единственным классом генов с плохой оценкой энхансеров. Более того, авторы продемонстрировали, что многие гены регулируются несколькими независимыми активными энхансерами даже в одном типе клеток. Более того, уровни экспрессии генов в среднем коррелировали с суммой сил энхансеров на ген, что подтверждает прямую связь между экспрессией гена и активностью энхансера.[1]

Характеристика регуляторных вариантов аллелей в когортах генетических исследований человека

Применяя эту технологию для характеристики и открытия регуляторных вариантных аллелей, Vockley et al.[10] охарактеризовали влияние генетической изменчивости человека на функцию некодирующих регуляторных элементов, измерив активность 100 предполагаемых энхансеров, захваченных непосредственно из геномов 95 членов исследуемой когорты. Этот подход позволяет функционально тонкое картирование причинных регуляторных вариантов в областях высокого неравновесия по сцеплению, идентифицированных eQTL анализы. Этот подход обеспечивает общий путь вперед для выявления нарушений в регуляторных элементах генов, которые вносят вклад в сложные фенотипы.

Количественная оценка энхансерной активности фрагментов ДНК, обогащенных ChIP

STARR-seq использовался для измерения регуляторной активности фрагментов ДНК, которые были обогащены сайтами, занятыми специфическими факторами транскрипции. Клонирование ЧИП Библиотеки ДНК, полученные в результате иммунопреципитации хроматина рецептор глюкокортикоидов в STARR-seq позволил количественно оценить индуцированную глюкокортикоидами активность энхансера в масштабе генома.[11] Этот подход полезен для измерения различий в активности энхансеров между сайтами, которые связаны одним и тем же фактором транскрипции.

Преимущества

  • Количественный анализ генома для обнаружения энхансеров.[1]
  • Применимый метод для скрининга произвольных источников ДНК в любом типе клеток или тканей, который позволяет адекватное введение репортерных конструкций.[1]
  • Метод с высокой степенью обнаружения (> 99%) за счет использования парного секвенирования даже для последовательностей, содержащих элементы, дестабилизирующие транскрипт.
  • Методика количественной оценки силы энхансеров и выявления эндогенно подавленных энхансеров путем их интеграции в хромосомный контекст.[1]

Будущие направления

STARR-seq, комбинируя традиционный подход с технологией высокопроизводительного секвенирования и узкоспециализированными методами био-вычислений, может обнаруживать энхансеры количественно и по всему геному. Изучение регуляции генов и их ответственных путей в геноме во время нормального развития, а также при болезни может быть очень сложным. Таким образом, применение STARR-seq ко многим типам клеток в организмах поддерживает идентификацию генных регуляторных элементов, специфичных для конкретного типа клеток, и практически оценивает некодирующие мутации вызывая болезнь. Недавно родственный подход, связанный с захватом интересующих областей с методом STARR-seq, был разработан и широко апробирован на линиях клеток млекопитающих.[12]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k л Арнольд, Косма; Даниэль Герлах; Кристоф Стельцер; Лукаш М. Борынь; Мартина Рат; Александр Старк (январь 2013 г.). «Полногеномные карты активности количественных усилителей, идентифицированные с помощью STARR-seq». Наука. 339 (6123): 1074–7. Дои:10.1126 / science.1232542. PMID  23328393.
  2. ^ а б c Сюй, Цзянь; Стивен Т. Смейл (ноябрь 2012 г.). «Создание улучшающего ландшафта». Клетка. 151 (5): 929–931. Дои:10.1016 / j.cell.2012.11.007. ЧВК  3732118. PMID  23178114.
  3. ^ Онг, Чин-Тонг; Виктор Г. Корсес (апрель 2011 г.). «Функция усилителя: новый взгляд на регуляцию тканеспецифической экспрессии генов». Природа Обзоры Генетика. 12 (4): 283–293. Дои:10.1038 / nrg2957. ЧВК  3175006. PMID  21358745.
  4. ^ Бейкер, Моня (28 апреля 2011 г.). «Усилители мелирования». Методы природы. 8 (5): 373. Дои:10.1038 / nmeth0511-373. PMID  21678620.
  5. ^ Беллен, Хьюго Дж (декабрь 1999 г.). «Десять лет обнаружения энхансеров: уроки с лету». Растительная клетка. 11 (12): 2271–2281. Дои:10.2307/3870954. JSTOR  3870954. ЧВК  144146. PMID  10590157.
  6. ^ Bier, E; Vaessin H; Пастух С; Лук-порей; McCall K; Barbel S; Акерман Л; Carretto R; Uemura T; Грелль Э (сентябрь 1989 г.). «Поиск паттернов и мутаций в геноме дрозофилы с помощью вектора P-lacZ». Гены и развитие. 3 (9): 1273–1287. Дои:10.1101 / gad.3.9.1273. PMID  2558049.
  7. ^ Уилсон, К; Пирсон РК; Bellen HJ; О’Кейн CJ; Grossniklaus U; Геринг WJ (сентябрь 1989 г.). «Обнаружение энхансера, опосредованного Р-элементом: эффективный метод выделения и характеристики генов, регулируемых развитием, у дрозофилы». Гены и развитие. 3 (9): 1301–1313. Дои:10.1101 / gad.3.9.1301. PMID  2558051.
  8. ^ О'Кейн, CJ; Геринг WJ (декабрь 1987 г.). «Обнаружение in situ геномных регуляторных элементов у дрозофилы». Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24): 9123–9127. Дои:10.1073 / пнас.84.24.9123. ЧВК  299704. PMID  2827169.
  9. ^ Волгер, Г; Городской J (июль 2008 г.). «Фактор транскрипции Zfh1 участвует в регуляции экспрессии нейропептидов и роста нервно-мышечных соединений личинок у Drosophila melanogaster». Биология развития. 319 (1): 78–85. Дои:10.1016 / j.ydbio.2008.04.008. PMID  18499094.
  10. ^ Vockley, Christopher M .; Го, Конг; Майорос, Уильям Х .; Нодзенский, Михаил; Scholtens, Denise M .; Хейс, М. Джеффри; Лоу, Уильям Л .; Редди, Тимоти Э. (01.08.2015). «Массовая параллельная количественная оценка регуляторных эффектов некодирующих генетических вариаций в когорте людей». Геномные исследования. 25 (8): 1206–1214. Дои:10.1101 / гр.190090.115. ISSN  1549-5469. ЧВК  4510004. PMID  26084464.
  11. ^ Vockley, Christopher M .; Д’Ипполито, Энтони М .; Макдауэлл, Ян С.; Майорос, Уильям Х .; Сафи, Алексиас; Песня, Линьюнь; Кроуфорд, Грегори Э .; Редди, Тимоти Э. (2015-08-25). «Сайты прямого связывания GR усиливают кластеры связывания TF в геноме человека». Клетка. 166 (5): 1269–1281. Дои:10.1016 / j.cell.2016.07.049. ISSN  0092-8674. ЧВК  5046229. PMID  27565349.
  12. ^ Vanhille L., A. Griffon, M.A. Maqbool, J. Zacarias, L.T.M. Дао, Н. Фернандес, Б. Баллестер, Дж. К. Андрау, С. Спикулия (2015). CapStarr-seq: высокопроизводительный метод количественной оценки активности энхансеров у млекопитающих. Nat. Commun. 6: 6905.