Библиотека (биология) - Library (biology)

Мутагенез насыщения сайта это тип сайт-направленный мутагенез. На этом изображении показан мутагенез насыщения в одном положении теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет собой первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Как библиотеки ДНК генерируются случайный мутагенез пространство последовательности образцов. Показана аминокислота, замещенная в данном положении. Каждая точка или набор связанных точек является одним из членов библиотеки. ПЦР, подверженная ошибкам, случайным образом изменяет некоторые остатки на другие аминокислоты. Аланиновое сканирование заменяет каждый остаток белка на аланин, один за другим. Насыщение сайта заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторые их подмножества) в одном положении, одну за другой.

В молекулярная биология, а библиотека представляет собой набор фрагментов ДНК, которые хранятся и размножаются в популяции микроорганизмов в процессе молекулярное клонирование. Существуют разные типы библиотек ДНК, в том числе библиотеки кДНК (сформированный из обратная транскрибированная РНК ), геномные библиотеки (сформированные из геномной ДНК) и рандомизированные мутантные библиотеки (сформированные путем синтеза гена de novo, в которые включены альтернативные нуклеотиды или кодоны). Технология библиотеки ДНК - основа современных молекулярная биология, генная инженерия, и белковая инженерия, и применение этих библиотек зависит от источника исходных фрагментов ДНК. Есть различия в клонирование векторов и методы, используемые при получении библиотеки, но в целом каждый фрагмент ДНК уникальным образом вставляется в вектор клонирования, а затем пул рекомбинантных молекул ДНК переносится в популяцию бактерии (а Бактериальная искусственная хромосома или библиотека ВАС) или дрожжи, так что каждый организм содержит в среднем одну конструкцию (вектор + вставка). По мере того, как популяция организмов растет в культуре, содержащиеся в них молекулы ДНК копируются и размножаются (таким образом, «клонируются»).

Терминология

Термин «библиотека» может относиться к популяции организмов, каждый из которых несет молекулу ДНК, вставленную в вектор клонирования, или, альтернативно, к коллекции всех клонированных векторных молекул.

библиотеки кДНК

Основная статья: библиотека кДНК

А библиотека кДНК представляет собой образец мРНК очищенный из определенного источника (либо совокупности клеток, определенной ткани или всего организма), который был преобразован обратно в матрицу ДНК с использованием фермента обратная транскриптаза. Таким образом, он представляет гены, которые активно транскрибировались в этом конкретном источнике в физиологических условиях, условиях развития или окружающей среды, которые существовали, когда мРНК была очищена. Библиотеки кДНК могут быть созданы с использованием методов, которые способствуют «полноразмерным» клонам, или в условиях, которые генерируют более короткие фрагменты, используемые для идентификации «выраженные теги последовательности ".

Библиотеки кДНК полезны в обратной генетике, но они представляют только очень небольшую (менее 1%) часть общего генома в данном организме.

Приложения библиотек кДНК включают:

• Открытие новых генов
• Клонирование полноразмерных молекул кДНК для in vitro изучение функции генов
• Изучение репертуара мРНК, экспрессируемых в разных клетках или тканях.
• Исследование альтернативное сращивание в разных клетках или тканях

Геномные библиотеки

Основная статья: геномная библиотека

А геномная библиотека представляет собой набор клонов, которые вместе представляют весь геном данного организма. Количество клонов, составляющих геномную библиотеку, зависит от (1) размера рассматриваемого генома и (2) размера вставки, допустимого для конкретной клонирование вектор система. Для большинства практических целей тканевой источник геномной ДНК не важен, поскольку каждая клетка тела содержит практически идентичную ДНК (за некоторыми исключениями).

Приложения геномных библиотек включают:

• Определение полной последовательности генома данного организма (см. геномный проект )
• Служит источником геномной последовательности для генерации трансгенные животные через генная инженерия
• Изучение функции регуляторные последовательности in vitro
• Исследование генетические мутации в рак ткани

Библиотеки синтетических мутантов

Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т.е. с использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий), и область, которая отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству различных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области (отдельные мутанты показаны разными цветами ниже).

В отличие от типов библиотек, описанных выше, существует множество искусственных методов создания библиотек вариантных генов.^[1] Вариации по всему гену могут быть внесены случайным образом: подверженная ошибкам ПЦР,^[2] Перетасовка ДНК рекомбинировать части схожих генов вместе,^[3] или методы на основе транспозонов для введения инделы.^[4]В качестве альтернативы, мутации могут быть нацелены на определенные кодоны во время de novo синтез или насыщающий мутагенез построить один или несколько точечные мутанты гена контролируемым образом.^[5] Это приводит к смеси двухцепочечных молекул ДНК, которые представляют собой варианты исходного гена.

В выразил Затем белки из этих библиотек могут быть подвергнуты скринингу на варианты, которые проявляют благоприятные свойства (например, стабильность, сродство связывания или ферментативную активность). Это можно повторять в циклах создания вариантов генов и скрининга продуктов экспрессии в направленная эволюция обработать.^[1]

Обзор методов подготовки библиотеки кДНК

Извлечение ДНК

При создании библиотеки мРНК (например, с клонами кДНК) существует несколько возможных протоколов выделения мРНК полной длины. Для извлечения ДНК из библиотек геномной ДНК (также известной как гДНК) может быть полезен мини-препарат ДНК.

Подготовить вставки

Библиотеки кДНК требуют осторожности, чтобы гарантировать, что клоны мРНК полной длины захватываются в виде кДНК (которая позже будет вставлена ​​в векторы). По этой причине было разработано несколько протоколов для оптимизации синтеза 1-й цепи кДНК и 2-й цепи кДНК, а также для повышения вероятности направленного клонирования в вектор.

Фрагменты гДНК генерируются из экстрагированной гДНК с использованием неспецифических рестрикционных ферментов с частым резанием.

Векторы

Интересующие нуклеотидные последовательности сохраняются как вставки в плазмида или геном бактериофаг который использовался для заражения бактериальных клеток.

Чаще всего векторы размножаются в бактериальных клетках, но при использовании YAC (искусственная хромосома дрожжей) можно использовать дрожжевые клетки. Векторы также могут быть размножены в вирусах, но это может занять много времени и утомительно. Однако высокая эффективность трансфекции, достигаемая с помощью вирусов (часто фагов), делает их полезными для упаковки вектора (с лигированной вставкой) и последующего введения их в бактериальную (или дрожжевую) клетку.

Кроме того, для библиотек кДНК была разработана система, использующая фаг Lambda Zap II, ExAssist и 2 вида E. coli. Вместо этого также можно использовать систему Cre-Lox, использующую сайты loxP и экспрессию фермента рекомбиназы in vivo. Это примеры систем удаления in vivo. Иссечение in vitro включает субклонирование, часто с использованием традиционных рестрикционных ферментов и стратегий клонирования. Иссечение in vitro может занять больше времени и может потребовать большей практической работы, чем системы удаления in vivo. В любом случае системы позволяют перемещать вектор из фага в живую клетку, где вектор может реплицироваться и размножаться до тех пор, пока не будет использована библиотека.

Использование библиотек

Рабочий процесс скрининга синтетической библиотеки для выявления клеток, производящих интересующее химическое вещество.

Это включает в себя «скрининг» интересующих последовательностей. Для этого есть несколько возможных способов.

использованная литература

1. Ваджапей, Нарендра; Лю, Алекс Ю .; Форлони, Маттео (2018-03-01). «Случайный мутагенез с использованием ДНК-полимераз, подверженных ошибкам». Протоколы Колд-Спринг-Харбор. 2018 (3): pdb.prot097741. Дои:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN  1940-3402. PMID  29496818.
2. McCullum, Elizabeth O .; Уильямс, Береа А. Р .; Чжан, Джинглей; Чапут, Джон С. (2010), Браман, Джефф (редактор), «Случайный мутагенез с помощью склонной к ошибкам ПЦР», Протоколы мутагенеза in vitro: третье издание, Методы молекулярной биологии, Humana Press, 634, стр. 103–109, Дои:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN  9781607616528, PMID  20676978
3. Крамери А., Райлард С.А., Бермудес Э., Стеммер В.П. (январь 1998 г.). «Перетасовка ДНК семейства генов разных видов ускоряет направленную эволюцию». Природа. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998Натура.391..288C. Дои:10.1038/34663. PMID  9440693.
4. Джонс Д.Д. (май 2005 г.). «Удаление триплетных нуклеотидов в случайных положениях в гене-мишени: толерантность бета-лактамазы ТЕМ-1 к делеции аминокислоты». Исследования нуклеиновых кислот. 33 (9): e80. Дои:10.1093 / nar / gni077. ЧВК  1129029. PMID  15897323.
5. Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тин; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (01.09.2006). «Конструирование мутантной библиотеки в направленной молекулярной эволюции». Молекулярная биотехнология. 34 (1): 55–68. Дои:10.1385 / МБ: 34: 1: 55. ISSN  1559-0305. PMID  16943572.

внешние ссылки