МАГИЯ - MAGIChip - Wikipedia

ВОЛШЕБСТВА, также известный как "микрочипы гель-иммобилизованных соединений на чипе" или же "трехмерный ДНК-микрочипы", представляют собой устройства для молекулярной гибридизации, полученные путем иммобилизации олигонуклеотиды, ДНК, ферменты, антитела, и другие соединения на фотополимеризованной микроматрице полиакриламидный гель подушечки размером 100x100x20 мкм или меньше. Эта технология используется для анализа гибридизация нуклеиновых кислот, специфическое связывание ДНК и низкомолекулярных соединений с белками и белок-белковые взаимодействия.

Гелевые подушечки увеличивают поверхность для гибридизации в 50 раз по сравнению с типичными микрочипами, которые печатаются на плоской поверхности предметного стекла, которое обычно обрабатывается химическими соединениями, на которые прилипают зонды. Плотность зонда более 1012 молекул на гелевую подушку может быть достигнута благодаря трехмерной природе гелевых подушечек. Массив основан на стеклянной поверхности, к которой прикреплены небольшие блоки полиакриламидного геля. Каждая единица геля функционирует как отдельная реакционная ячейка, поскольку она окружена гидрофобной стеклянной поверхностью, предотвращающей смешивание раствора с единицами геля. Это закладывает основу для выполнения перевязка, одинарное расширение базы, ПЦР-амплификация ДНК, на чипе МАЛДИ-ТОФ масс-спектрометрии и другие реакции.

Рисунок 1. Слайд MAGIChip, показывающий трехмерную природу зондов в гелевых подушечках.

Историческое прошлое

Технология MAGIChip была разработана в результате сотрудничества между доктором Дэвидом Шталом из Вашингтонского университета и доктором Андреем Мирзабековым, ранее работавшим в Аргоннской национальной лаборатории. Андрей Мирзабеков инициировал разработку нового метода секвенирования ДНК путем гибридизации с олигонуклеотидами в 1988 году. Этот метод стал основой биотехнологии, в которой биологические микрочипы используются для быстрой идентификации структур ДНК, что имеет большое значение в борьбе с различными инфекциями. болезни.

В 1998 году было объявлено о совместном исследовательском проекте Motorola Inc, Packard Instrument Company и Аргоннской национальной лаборатории Министерства энергетики США. В 1999 году исследователи из Аргоннской национальной лаборатории подтолкнули к разработке технологии биочипов на основе микрочипов, которые они разработали совместно с Институт Энгельгардта чтобы предотвратить всемирную вспышку туберкулеза.

Motorola разработала производственные процессы для массового производства биочипов, а Packard разработала и изготовила аналитические инструменты для обработки и анализа биочипов. Вклад Аргонна в сочетании с Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта (EIMB), являлась интеллектуальной собственностью в виде 19 изобретений, связанных с биологическими микрочипами.

Но это сотрудничество между EIMB в Москве и Аргоннской национальной лабораторией в Иллинойсе и двумя другими коммерческими партнерами в США было разрушено в результате спора о договорных отношениях между сторонами в 2001 году. В результате этого спора доктор Андрей Мирзабеков ушел с поста директора Центр технологий биочипов в Аргонне.^{[нужна цитата ]}

Метод

На поверхности стекла (микроматрицы) создаются массивы гелевых элементов (подушечек), после чего на них наносятся и химически фиксируются различные соединения (зонды). Затем к этой микроматрице, содержащей иммобилизованные зонды в гелевых подушечках, добавляется тестовый образец, и реакции молекулярного распознавания проходят при определенных условиях. Тестовый образец флуоресцентный помечены для отслеживания молекулярных взаимодействий. Анализ молекулярных паттернов взаимодействия осуществляется с помощью специализированного программного обеспечения.

Рисунок 2: Камера фотополимеризации

Рисунок 3: Схема технологии MAGIChip

Массив гелевых элементов на предметном стекле готовится «фотополимеризацией». Полимеризуемый раствор акриламида наносят на полимеризация камера. Камера полимеризации состоит из кварцевой маски, двух тефлоновых прокладок и предметного стекла микроскопа, скрепленных двумя металлическими зажимами. На внутренней стороне кварцевой маски есть окна, прозрачные для ультрафиолета (УФ), расположенные определенным пространственным образом в непрозрачной пленке из хрома. Собранная камера, содержащая акриламидный гель, подвергается воздействию ультрафиолетового света, чтобы обеспечить полимеризацию только в тех положениях камеры, которые расположены непосредственно под прозрачными окнами.

Олигонуклеотиды или фрагменты ДНК необходимо активировать, чтобы они содержали химически реактивные группы, чтобы облегчить связывание с активированными гелевыми элементами. Активация зонда зависит от химии активации полиакриламидных гелей. Таким образом, для иммобилизации в альдегидсодержащем геле зонд должен иметь реактивную аминогруппу, и если гели активируются введением аминогрупп, зонды должны содержать свободную альдегидную группу. Зонды обычно получают путем введения химически активных групп в концевое положение олигонуклеотидов во время их синтеза.

Зонды для иммобилизации переносятся в гелевые элементы микроматрицы с помощью роботов-дозаторов. Волоконно-оптический штифт роботов имеет гидрофобную боковую поверхность и гидрофильный наконечник и работает при температуре росы, чтобы предотвратить испарение образца во время переноса. Активированные зонды химически иммобилизуют путем связывания олигонуклеотидов, несущих амино- или альдегидные группы, с гелевыми подложками, содержащими альдегидные или аминогруппы соответственно.

Целевые молекулы помечены флуоресцентные красители. Флуоресцентное обнаружение позволяет контролировать процесс в реальном времени с высоким пространственным разрешением. Критерии процедуры маркировки включают:

Это должно быть просто, быстро и недорого
Он должен быть применим как к РНК, так и к ДНК-мишеням.
Он должен быть совместим с фрагментацией, необходимой для уменьшения образования вторичной структуры.
Он должен позволять включение одной метки в один фрагмент для обеспечения надлежащего количественного определения интенсивности гибридизации.
Это должно позволить сочетать несколько красителей

Реакции амплификации на чипе

Амплификация на чипе реакции гибридизации служит очень полезным инструментом, когда ДНК или исследуемый белок присутствуют в относительно небольшой доле в молекулярной популяции, нанесенной на чип, например, когда речь идет о гене с одной копией или мРНК низкая численность.

В методе расширения с одной базой^[1] праймер гибридизируется с ДНК и удлиняется дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом, который соответствует нуклеотиду в полиморфном сайте. Выполнение этой реакции при температуре выше температуры плавления дуплекса между ДНК и иммобилизованным зондом обеспечивает быструю ассоциацию / диссоциацию целевой ДНК. Таким образом, одна и та же молекула ДНК вступает в реакцию со многими отдельными праймерами, что приводит к амплификации праймеров в каждой отдельной гелевой подушечке. Эта процедура применялась для идентификации мутации гена бета-глобина у пациентов с бета-талассемией и для выявления гена токсина сибирской язвы.

Рисунок 4. Реакция удлинения одного нуклеотида.

Чипы также обеспечивают хорошую платформу для выполнения ПЦР непосредственно на чипе (в отдельных гелевых подушечках), поскольку каждую гелевую подушечку легко изолировать от соседней, в отличие от типичных микрочипов, которые сталкиваются с серьезными проблемами при выполнении той же задачи

Для анализа результатов гибридизации с флуоресцентно мечеными молекулами-мишенями. флуоресцентные микроскопы работают. Прибор оборудован столом для образцов с контролируемой температурой для изменения температуры в реакционной камере, содержащей чип, в ходе эксперимента. Охлажденный устройство с зарядовой связью (CCD) камера используется для записи световых сигналов от чипа, которые затем отправляются в компьютерную программу для количественной оценки сигналов гибридизации по всему чипу. Данные, полученные в результате этих экспериментов, хранятся в базе данных и анализируются программным обеспечением, которое помогает проводить оценку, in silico экспериментирование, контроль качества оборудования и программного обеспечения.

Типы

олигонуклеотидные чипы

Индивидуальные олигонуклеотидные биочипы предназначены для опроса тестируемых образцов известных нуклеотидных последовательностей. Например, известные гены в тех случаях, когда кто-то интересуется уровнями их экспрессии при определенных условиях, гены, которые, как известно, содержат точечные мутации или являются полиморфными в данной популяции. Успех микроматрицы зависит от правильного выбора зондов в этих случаях.

Набор потенциальных зонды гибридизации создаются для каждой последовательности ДНК, образующей идеальные дуплексы с этой последовательностью. Потенциальные пробы, которые могут создавать неоднозначность в интерпретации паттерна гибридизации, исключаются на основании содержания AT в сравнении с GC и склонности к образованию шпилек и других типов стабильных вторичных структур, которые могут резко повлиять на интенсивность гибридизации.

Один из примеров успешного применения настраиваемых олигонуклеотидных чипов включает обнаружение бета-талассемия мутации у пациентов. Для диагностики мутаций бета-талассемии был разработан простой чип, содержащий шесть зондов, соответствующих различным бета-талассемии. генотипы и гибридизировали с ДНК, амплифицированной ПЦР, от здоровых людей и пациентов.^[2] Результаты гибридизации показали ожидаемые значительные различия в интенсивности сигнала между совпадающими и несовпадающими дуплексами, что позволяет надежно идентифицировать как гомозиготные, так и гетерозиготные мутации.

рРНК чипы

Эти чипы были разработаны для мишеней рибосомной РНК (рРНК), обычно используемых для обнаружения бактерий. рРНК очень распространены в клетке, составляя около 80% от содержания РНК типичной эукариотической клетки.^[3] РРНК предварительно амплифицируется бактериями и присутствует в количестве нескольких тысяч копий на клетку, что делает ее хорошей мишенью для микроанализов. Однонуклеотидные полиморфизмы, присутствующие в последовательности бактериальной рРНК, используются для дифференциации бактерий на уровне рода, вида и штамма. Это уникальная особенность микрочипа, которая не требует амплификации на основе ПЦР. Процесс обнаружения бактерий относительно прост. Бактерии культивируют, промывают и осаждают. Лизосома используется для лизиса гранул - для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновой кислоты. Лизованные бактерии пропускают через цветной препарат, в котором нуклеиновая кислота из клетки иммобилизуется, а другие остатки вымываются. Все процессы после лизиса - выделение, очистка, фрагментация и мечение целевых рРНК - представляют собой стабильные химические реакции. Фрагменты размером менее 500 п.н. легко гибридизуются с гелевой матрицей. Общее количество элюированных с чипа определяется УФ-спектрофотометром. Процесс от пробоподготовки до идентификации организмов на основе автоматизированных алгоритмов занимает 2 часа.

кДНК

кДНК, полученные в результате обратной транскрипции популяции мРНК, выделенной из клеток в различных физиологических и экспериментальных условиях, используются в качестве иммобилизованных зондов. Эти массивы широко используются для изучения экспрессии генов. Потенциальное препятствие при использовании кДНК связано с трудностью инъекции и равномерного распределения длинных молекул в гелевые подушечки. Эта проблема решается путем разработки полиакриламидных гелей с большим средним размером пор. Другой способ решения этой проблемы - случайное фрагментирование кДНК на относительно небольшие части перед иммобилизацией.

Белки

Протеин Могут быть приготовлены чипы, содержащие различные белки, иммобилизованные в виде зондов таким образом, чтобы сохранить их биологическую активность.^[4] Гель с большими порами используется для предотвращения диффузии белка в гель. Есть два способа иммобилизовать белки на гелевых подушечках. Первый основан на активации геля с глутиральдегид. Во второй процедуре гель активируется частичной заменой аминогрупп на гидразид группы. Реакция между гидразидными и альдегидными группами эффективно связывает белок с клеткой. Белковые микрочипы демонстрируют высокую специфичность реакций молекулярного распознавания в растворе. Взаимодействие между антигеном и их специфическими антителами можно изучить на чипе в различных экспериментальных условиях. Либо антиген или же антитело могут быть иммобилизованы и контролироваться как прямыми, так и косвенными методами. В прямом методе используются молекулы-мишени, меченные флуоресцентным красителем, а в непрямом методе реакция обнаруживается с помощью меченой молекулы, которая специфически распознает цель. Эти чипы могут использоваться для изучения ферментативной активности иммобилизованных ферменты путем покрытия чипа раствором, содержащим определенные подложки. За реакцией следят, обнаруживая образование окрашенных или флуоресцентных осадков.

Другие приложения

Их можно использовать для изучения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в своем методе. Поскольку бактериальная ДНК является высококонсервативной с течением времени, SNP полезны для идентификации бактерий на чипе, а поскольку SNP являются наиболее распространенными вариациями в геноме человека, они стали основными маркерами для генетических исследований для картирования и идентификации генов, чувствительных к сложным заболеваниям. .^[5]
Их можно использовать для обнаружения факторов вирулентности, то есть токсинов и белков, проникающих в организм. Эти токсины, как правило, имеют небольшое количество копий транскриптов и продуцируются в очень специфических условиях, обнаруженных в организме хозяина. Здесь стратегия идентификации сосредоточена на единственной копии последовательности ДНК, где MAGIChips очень эффективны.
Белковые биочипы делают это очень захватывающим, поскольку белки содержатся в одной ячейке, и все они могут быть проанализированы на одной платформе. Белковые биочипы можно использовать для идентификации белковых биомаркеров для диагностики заболеваний или конкретной стадии заболевания. Они также могут помочь определить взаимосвязь между структурой белка и функцией белка и определить функцию белка или разных белков в одном и том же или разных типах клеток. Хотя MAGIChips нуждаются в некоторых модификациях, приложения и методы вполне стандартные.^[6]
Чипы могут использоваться в качестве диагностического инструмента в клиниках благодаря быстрому обнаружению, высокой пропускной способности, достоверности результатов, иерархической идентификации и количественной оценке. С их помощью можно добиться времени, необходимого для сбора образцов, для представления результатов в клинических условиях в пределах 2 часов. Быстрое время выполнения работ является привлекательным признаком тестирования в месте оказания медицинской помощи, пока пациент ожидает результатов.
Эти устройства с высокой пропускной способностью позволяют проводить тысячи микробных зондов для видоспецифичной и даже штамм-специфической идентификации одновременно на одном чипе, уменьшая количество образцов, необходимых для проведения нескольких тестов. Потенциальные угрозы, создаваемые использованием бактерий, вирусов и грибов в качестве биологического оружия против людей, сельского хозяйства и окружающей среды, требуют разработки технологий для точного и чувствительного обнаружения в очень короткие сроки. Перспективная технология MAGIChip, которая использовалась для распознавания важных вирусов. Зонды грибов были введены в чипы рРНК для сельскохозяйственных исследований в области генетики, репродукции, болезней и даже защиты растений. Тысячи генов могут быть нацелены одновременно на поиск генетического разнообразия или микробной инвазии по своей природе или путем преднамеренного высвобождения.