Тест на нуклеиновую кислоту - Nucleic acid test

«НААТ» перенаправляется сюда. Не следует путать с Na`at, Наат (деревня), или же Наат (значения).
Ротавирус

А тест на нуклеиновую кислоту (NAT) - это метод, используемый для обнаружения конкретного нуклеиновая кислота последовательность и, следовательно, обычно для обнаружения и идентификации конкретного вида или подвида организма, часто вирус или же бактерии что действует как возбудитель в кровь, ткань, моча и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетический материал (РНК или же ДНК ) скорее, чем антигены или же антитела. Обнаружение генетических материалов позволяет ранней диагностике заболевания, поскольку для обнаружения антигенов и / или антител требуется время, чтобы они начали появляться в кровотоке.[1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают в себя этап, который усиливает генетический материал, то есть делает его множество копий. Такие NAT называются тесты амплификации нуклеиновых кислот (НААТ). Есть несколько способов усиления, в том числе полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ смещения цепи (SDA) или опосредованный транскрипцией анализ (ТМА).[2]

Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность Watson-Crick. базовая пара; однониточный зонд или грунтовка захват молекул ДНК или же РНК целевые молекулы дополнительные пряди. Таким образом, конструкция жил зондов очень важна для повышения чувствительность и специфичность обнаружения. Тем не менее мутанты которые составляют генетическую основу множества заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они различаются только в одной базе, например, вставки, удаления, и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В этом случае легко может произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложный положительный результат результаты, такие как ошибка напряжение то есть комменсальный для одного патогенного. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.

Достижения

Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двунитная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.

В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот.[3] Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент полностью комплементарен целевой последовательности. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается и становится менее термодинамически выгодной. Стандартная разность свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами для замены опоры на пальце ноги с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100 + со средним 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.

После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, которые также используют реакцию обмена пальцами ног.[4] Это позволило оптически обнаружить правильную цель и цель SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.

В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности по однонуклеотидным вариантам (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции».[5] В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, при минимуме 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами на основе гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.

Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР, получивший название Blocker Displacement Amplification (BDA).[6] Это термостойкая ПЦР, которая избирательно амплифицирует все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно определять сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.

Приложения

  • Диагностика гонококковой инфекции и других инфекций Neisseria: амплификация конкретных последовательностей ДНК или РНК N. gonorrhea для обнаружения.[7]
  • Диагностика урогенитальной инфекции C. trachomatis[8]
  • Обнаружение Mycobacterium tuberculosis[9]
  • Обнаружение РНК или ДНК ВИЧ[10]
  • Обнаружение зоонозных коронавирусов[11]

Рекомендации

  1. ^ «Что такое тест на нуклеиновую кислоту (NAT)?». Американский Красный Крест.
  2. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, патогены и практика (третье издание). Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  3. ^ Пэн Инь, Дэвид Чжан (2012). «Оптимизация специфичности гибридизации нуклеиновых кислот». Химия природы. 4 (3): 208–214. Bibcode:2012НатЧ ... 4..208Z. Дои:10.1038 / NCHEM.1246. ЧВК  4238961. PMID  22354435.
  4. ^ Георг Силиг, Шерри Чен (2013). «Условно флуоресцентные молекулярные зонды для обнаружения изменений одного основания в двухцепочечной ДНК». Химия природы. 5 (9): 782–789. Bibcode:2013НатЧ ... 5..782С. Дои:10.1038 / NCHEM.1713. ЧВК  3844531. PMID  23965681.
  5. ^ Дэвид Чжан, Цзюэсяо Шерри Ван (2015). «Дизайн ДНК-зонда на основе моделирования для последовательной сверхспецифической гибридизации». Химия природы. 7 (7): 545–553. Bibcode:2015НатЧ ... 7..545Вт. Дои:10.1038 / NCHEM.2266. ЧВК  4479422. PMID  26100802.
  6. ^ Дэвид Чжан, Люсия Р. Ву (2017). «Мультиплексное обогащение редких вариантов ДНК посредством селективной по последовательности и устойчивой к температуре амплификации». Природа Биомедицинская инженерия. 1 (9): 714–723. Дои:10.1038 / s41551-017-0126-5. ЧВК  5969535. PMID  29805844.
  7. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, патогены и практика (третье издание). Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  8. ^ Вентилятор, Хуэйчжоу (2015). Молекулярная медицинская микробиология (второе издание). Академическая пресса. С. 1449–1469.
  9. ^ Риддерхоф, Джон C (2009). Туберкулез. Эльзевир. С. 738–745.
  10. ^ Гиллеспи, Сьюзен Л. (2013). Клиническая иммунология (четвертое издание). Эльзевир. С. 465–479.
  11. ^ Шмидт, Майкл; Брикснер, Вероника; Рустер, Бриджит; Hourfar, Майкл К .; Дростен, Кристиан; Прайзер, Вольфганг; Зейфрид, Эрхард; Рот, В. Курт (апрель 2004 г.). «NAT-скрининг доноров крови на коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома может потенциально предотвратить передачу, связанную с переливанием крови». Переливание. 44 (4): 470–475. Дои:10.1111 / j.1537-2995.2004.03269.x. ISSN  0041-1132. PMID  15043560.