ПРАЙМ (включение в пробу, опосредованное ферментами) - PRIME (PRobe Incorporation Mediated by Enzymes)

ОСНОВНОЙ (Инкорпорация PRobe, опосредованная ферментами) является молекулярная биология инструмент исследования, разработанный Алиса Ю. Тинг и Ting Lab в Массачусетский технологический институт для сайт-специфической маркировки белков в живых клетках с помощью химических зондов.[1][2] Зонды часто обладают полезными биофизическими свойствами, такими как флуоресценция и позволяют визуализировать белки.[1] В конечном итоге PRIME позволяет ученым изучать функции конкретных интересующих белков.

Значимость

Мечение белков с помощью флуоресцентных молекул позволяет визуализировать динамику белка, локализацию и белок-белковые взаимодействия, и поэтому служит важным методом для понимания функций и сетей белков в живых клетках.[3] Маркировка белка должна иметь высокую селективность в отношении интересующего белка и не должна мешать естественным функциям белка. Хотя генетическое кодирование флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), является наиболее популярным методом из-за его высокой специфичности, флуоресцентные белки могут мешать функциям белка, с которым они слиты, из-за их большого размера.[3] Существует множество инструментов для маркировки, таких как HaloTag, SNAP tag и FlAsH, разработанных для преодоления слабости традиционного мечения белков с помощью флуоресцентных белков. Однако они все еще имеют существенные недостатки либо из-за большого размера метки, либо из-за низкой специфичности процесса маркировки.[4] PRIME был разработан для достижения высокой специфичности мечения, сравнимой с флуоресцентными белками с небольшими молекулами.[4]

Принципы

В PRIME мутант фермент LplA (лигаза липоевой кислоты из кишечная палочка ) сначала катализирует конъюгацию «ручки функциональной группы» и акцептора LplA пептид (LAP), который генетически слит с интересующим белком.[1][4][5] «Маркер функциональной группы» указывает на мостиковую молекулу, соединяющую метку LAP с флуоресцентным зондом или флуорофор. Флуоресцентный зонд реагирует с «маркером функциональной группы», соединенным с меткой, и в конечном итоге маркирует интересующий белок. Для присоединения флуоресцентного зонда к комплексу, состоящему из белка, метки LAP и мостика, можно использовать различные химические реакции: Реакция Дильса-Альдера,[6] и катализируемое медью азид-алкиновое циклоприсоединение с помощью хелатирования (CuAAC) (см. Азид-алкиновое циклоприсоединение Huisgen ).[7] Две другие версии технологий маркировки PRIME используют мутантные белки LplA для непосредственного включения флуорофора в интересующий белок с меткой LAP.[8][9]

Ограничения

Несмотря на преимущества PRIME по сравнению с другими методами тегирования, PRIME все же имеет некоторые возможные ограничения. Прежде всего, метка LAP может нарушать функцию белков, с которыми она слита.[1] Экспериментаторам рекомендуется провести контрольные эксперименты, чтобы убедиться, что меченый рекомбинантный белок функционирует должным образом.[1] Во-вторых, даже при низкой концентрации химические вещества, такие как флуоресцентный зонд, могут быть токсичными для клеток.[1] Экспериментаторам также необходимо достичь правильного баланса между максимальным сигналом флуоресценции и минимальным нарушением клеточной функции.[1]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм Уттамапинант С., Санчес М.И., Лю Д.С., Яо Дж.З., Тинг А.Ю. (август 2013 г.). «Маркировка белков с использованием специфических сайтов с использованием PRIME и химии щелчков с помощью хелатирования». Нат Проток. 8 (8): 1620–34. Дои:10.1038 / nprot.2013.096. ЧВК  4892701. PMID  23887180.
  2. ^ Tschesche H, ed. (2011). Методы биохимии белков. Берлин: Де Грюйтер. ISBN  978-3-11-025236-1.
  3. ^ а б Сох Н (19 февраля 2008 г.). «Селективное химическое маркирование белков малыми флуоресцентными молекулами на основе методологии хелатирования металлов». Датчики. 8 (2): 1004–1024. Дои:10.3390 / с8021004. ЧВК  3927527.
  4. ^ а б c Яо Дж. З., Уттамапинант С., Полухтин А., Баскин Дж. М., Коделли Дж. А., Слеттен Э. М., Бертоцци CR, Попик В. В., Тинг А. Ю. (2012). «Нацеливание флуорофора на клеточные белки посредством ферментно-опосредованного азидного лигирования и штаммового циклоприсоединения». Варенье. Chem. Soc. 134 (8): 3720–8. Дои:10.1021 / ja208090p. ЧВК  3306817. PMID  22239252.
  5. ^ Демченко А.П., Брауэр А.М., изд. (2011). Продвинутые репортеры флуоресценции в химии и биологии. Гейдельберг: Springer. ISBN  978-3-642-18034-7.
  6. ^ Лю Д.С., Тангпирачайкул А., Селварадж Р., Тейлор М. Т., Фокс Дж. М., Тинг А. Ю. (2012). «Циклоприсоединение Дильса-Альдера для нацеливания флуорофора на специфические белки внутри живых клеток». Варенье. Chem. Soc. 134 (2): 792–5. Дои:10.1021 / ja209325n. ЧВК  3381951. PMID  22176354.
  7. ^ Уттамапинант С., Тангпирачайкул А., Грециан С., Кларк С., Сингх Ю., Слэйд П., Джи К. Р., Тинг А. Ю. (2012). «Быстрая, совместимая с клетками химия щелчков с хелатирующими медь азидами для биомолекулярного мечения». Энгью. Chem. Int. Эд. Англ. 51 (24): 5852–6. Дои:10.1002 / anie.201108181. ЧВК  3517120. PMID  22555882.
  8. ^ Уттамапинант С., Уайт К.А., Баруа Х., Томпсон С., Фернандес-Суарес М., Путенвитил С., Тинг А.Ю. (2010). «Флуорофорная лигаза для сайт-специфической маркировки белков внутри живых клеток». Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24): 10914–9. Дои:10.1073 / pnas.0914067107. ЧВК  2890758. PMID  20534555.
  9. ^ Лю Д.С., Нивон Л.Г., Рихтер Ф., Голдман П.Дж., Деринк Т.Дж., Яо Дж.З., Фиппс В.С., Эллисман М.Х., Дреннан С.Л., Бейкер Д., Тинг А.Ю. (2014). «Вычислительный дизайн красной флуорофорной лигазы для сайт-специфической маркировки белков в живых клетках». Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43): E4551–9. Дои:10.1073 / pnas.1404736111. ЧВК  4217414. PMID  25313043.