Оптимизация полимеразной цепной реакции - Polymerase chain reaction optimization

В полимеразной цепной реакции (ПЦР) - широко используемый инструмент молекулярной биологии для амплификации ДНК, а также различные методы для Оптимизация ПЦР которые были разработаны молекулярными биологами для повышения эффективности ПЦР и минимизации сбоев.

Загрязнение и ПЦР

Метод ПЦР чрезвычайно чувствителен и требует всего нескольких молекул ДНК в одной реакции для амплификации на несколько порядков. Следовательно, необходимо принять адекватные меры для предотвращения заражения любой ДНК, присутствующей в лабораторной среде (бактерии, вирусы, или человеческие источники). Поскольку продукты предыдущих амплификаций ПЦР являются обычным источником заражения, многие лаборатории молекулярной биологии внедрили процедуры, предусматривающие разделение лаборатории на отдельные зоны.[1] Одно лабораторное пространство предназначено для подготовки и обращения с реагентами до ПЦР и настройки реакции ПЦР, а другое - для обработки после ПЦР, например гель-электрофорез или очистка продукта ПЦР. Для настройки реакций ПЦР многие стандартные рабочие процедуры вовлекать использование пипетки с советы по фильтрам и носить свежие лабораторные перчатки, а в некоторых случаях шкаф с ламинарным потоком с УФ-лампой в качестве рабочей станции (для уничтожения любых экстранеомультимер формирование). ПЦР обычно оценивается по отрицательный контроль реакция, которая проводится аналогично экспериментальной ПЦР, но без ДНК-матрицы и проводится вместе с экспериментальной ПЦР.

Заколки для волос

Вторичные конструкции в ДНК может приводить к сворачиванию или связыванию ДНК-матрицы или праймеров, что приводит к снижению выхода продукта или провалу реакции. Заколки для волос, которые состоят из внутренних складок, вызванных спариванием оснований между нуклеотидами, являются инвертированными повторами в одноцепочечной ДНК, являются обычными вторичными структурами и могут привести к неудачным ПЦР.

Как правило, дизайн праймеров включает проверку потенциальных вторичных структур в праймерах или добавление ДМСО или же глицерин к ПЦР для минимизации вторичных структур в матрице ДНК[2], используются при оптимизации ПЦР, которые в анамнезе неудачны из-за подозреваемых шпилек ДНК.

Полимеразные ошибки

Полимераза Taq не хватает От 3 до 5 футов экзонуклеазная активность. Таким образом, Taq не содержит ошибок -корректура, который заключается в удалении любого вновь включенного нуклеотидного основания из возникающей (т. е. расширяющейся) цепи ДНК, которое не совпадает со своим противоположным основанием в комплементарной цепи ДНК. Отсутствие проверки фермента Taq от 3 'до 5' приводит к высокому уровню ошибок (мутации на нуклеотид за цикл) примерно 1 на 10000 оснований, что влияет на точность ПЦР, особенно если ошибки возникают на ранних этапах ПЦР с низкое количество исходного материала, вызывающее накопление большой доли амплифицированной ДНК с неправильной последовательностью в конечном продукте.[3]

Несколько «высокоточных» ДНК-полимераз, имеющих сконструированную 3'-5'-экзонуклеазную активность, стали доступными, что позволяет более точную амплификацию для использования в ПЦР для секвенирования или клонирования продуктов. Примеры полимераз с экзонуклеазной активностью от 3 'до 5' включают: ДНК-полимеразу KOD, рекомбинантную форму Термококк кодакараенсис KOD1; Вентиляционное отверстие, которое извлекается из Термококк литоралис; ДНК-полимераза Pfu, который извлекается из Pyrococcus furiosus; и Pwo, который извлекается из Pyrococcus woesii.[4]

Концентрация магния

Магний необходим в качестве кофактора для термостабильной ДНК-полимеразы. Полимераза Taq - это магний-зависимый фермент, и определение оптимальной концентрации для использования имеет решающее значение для успеха реакции ПЦР.[5] Некоторые компоненты реакционной смеси, такие как концентрация матрицы, дНТФ и присутствие хелатирующие агенты (EDTA ) или же белки может уменьшить количество присутствующего свободного магния, тем самым снижая активность фермента.[6] Праймеры, которые связываются с неправильными сайтами матрицы, стабилизируются в присутствии чрезмерных концентраций магния, что приводит к снижению специфичности реакции. Чрезмерные концентрации магния также стабилизируют двухцепочечную ДНК и предотвращают полную денатурацию ДНК во время ПЦР, снижая выход продукта.[5][6] Неадекватное оттаивание MgCl2 может привести к образованию градиентов концентрации внутри хлорид магния раствор, поставляемый с ДНК-полимеразой, а также способствует множеству неудачных экспериментов.[6]

Размер и другие ограничения

ПЦР легко работает с ДНК-матрицей длиной от двух до трех тысяч пар оснований. Однако, превышая этот размер, выход продукта часто снижается, так как с увеличением длины стохастический такие эффекты, как преждевременное прекращение действия полимеразы, начинают влиять на эффективность ПЦР. Возможно усиление более крупных частей до 50 000 пар оснований с помощью более медленного цикла нагрева и специальных полимераз. Это полимеразы сплавлен к ДНК-связывающему белку, повышающему процессивность, усиливая прилипание полимеразы к ДНК.[7][8]

Другие ценные свойства химерных полимераз TopoTaq и PfuC2 включают повышенную термостабильность, специфичность и устойчивость к загрязнениям и ингибиторы.[9][10] Они были созданы с использованием уникальных спираль-шпилька-спираль (HhH) ДНК-связывающие домены топоизомераза V[11] от гипертермофила Метанопирус кандлери. Химерные полимеразы преодолевают многие ограничения нативных ферментов и используются в прямой ПЦР-амплификации из клеточных культур и даже образцов пищи, минуя трудоемкие этапы выделения ДНК. Сильная активность гибридной полимеразы TopoTaq по замещению цепи помогает решить проблемы ПЦР, которые могут быть вызваны: заколки для волос и G-загруженный двойные спирали. Спирали с высоким содержанием G-C обладают более высокой температурой плавления, что часто ухудшает ПЦР в зависимости от условий.[12]

Неспецифическое грунтование

Неспецифическое связывание праймеров происходит часто и может происходить по нескольким причинам. К ним относятся повторяющиеся последовательности в матрице ДНК, неспецифическое связывание между праймером и матрицей, высокое или низкое содержание G-C в матрице или неполное связывание праймера, при котором 5'-конец праймера остается не прикрепленным к матрице. Неспецифическое связывание вырожденные праймеры также обычное дело. Манипулирование отжиг температура и магний концентрация ионов может быть использована для повышения специфичности. Например, более низкие концентрации магния или других катионов могут предотвратить неспецифические взаимодействия праймеров, что позволит успешно провести ПЦР. Фермент полимеразы «горячего старта», активность которого блокируется, если он не нагревается до высокой температуры (например, 90–98 ° C) во время денатурация Этап первого цикла обычно используется для предотвращения неспецифического прайминга во время подготовки реакции при более низких температурах. Химически опосредованная ПЦР с горячим стартом требует более высоких температур и более длительного времени инкубации для активации полимеразы по сравнению с ПЦР с горячим стартом на основе антител или аптамеров.[нужна цитата ]

Другие методы повышения специфичности включают: Вложенная ПЦР и Touchdown PCR.

Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР (Электронная ПЦР ) может быть выполнено для облегчения проектирования грунтовки.[13]

Полимеразная цепная реакция приземления или полимеразная цепная реакция типа приземления - это метод полимеразной цепной реакции, с помощью которого праймеры избегают амплификации неспецифических последовательностей. Температура отжига во время полимеразной цепной реакции определяет специфичность отжига праймера. Температура плавления праймера устанавливает верхний предел температуры отжига. При температурах чуть ниже этой точки будет происходить только очень специфическое спаривание оснований между праймером и матрицей. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймера скрывает результаты полимеразной цепной реакции, поскольку неспецифические последовательности, с которыми отжигаются праймеры на ранних этапах амплификации, будут «вытеснять» любые конкретные последовательности из-за экспоненциальной природы амплификации полимеразы.

Самые ранние стадии цикла полимеразной цепной реакции касания имеют высокие температуры отжига. Температуру отжига постепенно снижают для каждого последующего набора циклов (количество отдельных циклов и приращений снижения температуры выбирает экспериментатор). Праймер будет отжигаться при наивысшей температуре, которая в наименьшей степени допускает неспецифическое связывание, которое он способен переносить. Таким образом, первая амплифицированная последовательность находится между областями наибольшей специфичности праймера; скорее всего, это интересующая последовательность. Эти фрагменты будут далее амплифицироваться во время последующих циклов при более низких температурах и будут конкурировать с неспецифическими последовательностями, с которыми праймеры могут связываться при этих более низких температурах. Если праймер первоначально (во время высокотемпературных фаз) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть выполнены с продуктом для дальнейшей амплификации этих фрагментов.

Праймеры димеры

Отжиг 3 'конец одного грунтовка сам по себе или второй праймер может вызывать удлинение праймера, что приводит к образованию так называемых димеров праймера, видимых как низкомолекулярные полосы на ПЦР гели.[14] Образование димера праймера часто конкурирует с образованием интересующего фрагмента ДНК, и его можно избежать, используя праймеры, которые сконструированы таким образом, что в них отсутствует взаимодополняемость - особенно на 3 'концах - самому себе или другому праймеру, используемому в реакции. Если дизайн праймера ограничен другими факторами и если димеры праймеров действительно возникают, методы ограничения их образования могут включать оптимизацию MgCl2 концентрации или повышения температуры отжига в ПЦР.[14]

Дезоксинуклеотиды

Дезоксинуклеотиды (dNTP) могут связывать Mg2+ ионы и таким образом влияют на концентрацию свободных ионов магния в реакции. Кроме того, чрезмерное количество dNTP может увеличить частоту ошибок ДНК-полимеразы и даже ингибировать реакцию.[5][6] Дисбаланс в пропорции четырех дНТФ может привести к неправильному включению во вновь образовавшуюся цепь ДНК и способствовать снижению точности ДНК-полимеразы.[15]

Рекомендации

  1. ^ Балин Б.Дж., Жерар Х.С., Аркинг Э.Дж. и др. (1998). «Идентификация и локализация Chlamydia pneumoniae в мозге Альцгеймера». Med. Microbiol. Иммунол. 187 (1): 23–42. Дои:10.1007 / s004300050071. PMID  9749980. S2CID  25307947. Во всех анализах были приняты особые меры, чтобы избежать перекрестного загрязнения как анализируемых образцов нуклеиновых кислот, так и реакционных смесей; такие меры включали приготовление нуклеиновых кислот в лаборатории отдельно от тех, в которых проводились анализы ПЦР или обратной транскрипции (ОТ) -ПЦР, и использование восьми различных биологических шкафов, каждый в своей лаборатории, для проведения реакций.
  2. ^ «Часто задаваемые вопросы по полимеразам и амплификации». Биолаборатории Новой Англии.
  3. ^ Эккерт К.А., Кункель Т.А. (август 1991 г.). «Верность ДНК-полимеразы и полимеразная цепная реакция». Методы ПЦР Приложение. 1 (1): 17–24. Дои:10.1101 / гр.1.1.17. PMID  1842916.
  4. ^ Lundberg, Kelly S .; Сапожник, Дэн Д.; Адамс, Майкл W.W .; Шорт, Джей М .; Зорге, Джозеф А .; Матур, Эрик Дж. (1991). «Высокоточная амплификация с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Pyrococcus furiosus». Ген. 108 (1): 1–6. Дои:10.1016 / 0378-1119 (91) 90480-у. PMID  1761218.
  5. ^ а б c Маркулатос П., Сиафакас Н., Монкань М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход». J. Clin. Лаборатория. Анальный. 16 (1): 47–51. Дои:10.1002 / jcla.2058. ЧВК  6808141. PMID  11835531.
  6. ^ а б c d «Протоколы и рекомендации по амплификации нуклеиновых кислот». Архивировано из оригинал на 2009-02-02. Получено 2009-01-28. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  7. ^ Павлов А.Р., Белова Г.И., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2002). «Мотивы спираль-шпилька-спираль придают устойчивость к соли и процессивность химерных ДНК-полимераз». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 99 (21): 3510–13515. Bibcode:2002ПНАС ... 9913510П. Дои:10.1073 / pnas.202127199. ЧВК  129704. PMID  12368475.
  8. ^ Демидов В.В. (2002). «Счастливый брак: развитие ДНК-полимераз с добавками ДНК-топоизомеразы». Тенденции биотехнологии. 20 (12): 491. Дои:10.1016 / S0167-7799 (02) 02101-7.
  9. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Последние разработки в области оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения». Тенденции биотехнологии. 22 (5): 253–260. Дои:10.1016 / j.tibtech.2004.02.011. PMID  15109812.
  10. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Термостабильные химерные ДНК-полимеразы с высокой устойчивостью к ингибиторам». Амплификация ДНК: современные технологии и приложения. Horizon Bioscience. С. 3–20. ISBN  0-9545232-9-6.
  11. ^ Фортер П (2006). «ДНК-топоизомераза V: новая складка загадочного происхождения». Тенденции биотехнологии. 24 (6): 245–247. Дои:10.1016 / j.tibtech.2006.04.006. PMID  16650908.
  12. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: Сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами». В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки. Джонс и Бартлетт. С. 241–257. ISBN  0-7637-3383-0.
  13. ^ «Электронная ПЦР». NCBI - Национальный центр биотехнологической информации. Получено 13 марта 2012.
  14. ^ а б Крамер М.Ф., Коэн Д.М. (август 2006 г.). «Ферментативная амплификация ДНК методом ПЦР: стандартные процедуры и оптимизация». Curr Protoc Cytom. Приложение 3: A.3K.1 – A.3K.15. Дои:10.1002 / 0471142956.cya03ks37. PMID  18770830. S2CID  4658404.
  15. ^ Кунц Б.А., Кохалми С.Е. (1991). «Модуляция мутагенеза по уровням дезоксирибонуклеотидов». Анну. Преподобный Жене. 25: 339–59. Дои:10.1146 / annurev.ge.25.120191.002011. PMID  1812810.