Полимераза Taq - Taq polymerase

ДНК-полимераза I, термостабильная
PDB 1ktq EBI.jpg
Большой (кленовский) фрагмент Taq polA, содержащий polA и рудиментарные домены
Идентификаторы
ОрганизмThermus aquaticus
СимволПОЛЬША
UniProtP19821

Taq полимераза термостабильный ДНК-полимераза I названный в честь теплолюбивый эубактериальный микроорганизм Thermus aquaticus, из которого он был первоначально выделен Chien et al. в 1976 г.[1] Его название часто сокращается до Taq или же Taq pol. Часто используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод значительного увеличения количества коротких сегментов ДНК.

T. aquaticus это бактерия что живет в горячие источники и гидротермальные источники, и Taq полимераза была идентифицирована[1] как фермент способен выдерживать денатурирующие белок условия (высокая температура), необходимые во время ПЦР.[2] Поэтому он заменил ДНК-полимеразу из Кишечная палочка изначально использовался в ПЦР.[3]

Ферментативные свойства

Taq 'оптимальная температура для Мероприятия 75–80 ° C, при период полураспада более 2 часов при 92,5 ° C, 40 минут при 95 ° C и 9 минут при 97,5 ° C, и может повторить 1000 базовая пара цепь ДНК менее чем за 10 секунд при 72 ° C.[4] При 75-80 ° C, Taq достигает оптимального полимеризация скорость около 150 нуклеотиды в секунду на молекулу фермента, и любые отклонения от оптимального температурного диапазона ингибируют скорость удлинения фермента. Один Taq синтезирует около 60 нуклеотидов в секунду при 70 ° C, 24 нуклеотидов / сек при 55 ° C, 1,5 нуклеотидов / сек при 37 ° C и 0,25 нуклеотидов / сек при 22 ° C. При температуре выше 90 ° C, Taq проявляет очень небольшую активность или вообще не проявляет активности, но сам фермент не денатурирует и остается нетронутым.[5] Наличие определенных ионы в реакционном сосуде также влияет удельная активность фермента. Небольшие количества хлорид калия (KCl) и магний ион (Mg2+) продвигать Taqферментативная активность. Taq полимераза максимально активируется при 50 мМ KCl и правильной концентрации Mg2+ что определяется концентрацией нуклеозидтрифосфаты (дНТФ). Высокие концентрации KCl и Mg2+ подавлять Taqактивность.[6] Интересно, что обычный хелатор ионов металлов, EDTA, напрямую связывается с Taq в отсутствие этих ионов металлов.[7]

Один из Taq 'недостатком является отсутствие 3' к 5' экзонуклеаза корректура Мероприятия[4] что приводит к относительно низкой точности репликации. Первоначально частота ошибок составляла примерно 1 из 9000 нуклеотидов.[8] Некоторые термостабильные ДНК-полимеразы были выделены из других термофильных бактерий и архей, таких как Pfu ДНК-полимераза, занимающихся корректурой, и используются вместо (или в сочетании с) Taq для высококачественного усиления.[9] Верность может сильно различаться между Taq, оказывая огромное влияние на последующие приложения секвенирования.[10]

Taq производит продукты ДНК, содержащие A (аденин ) выступы на концах 3 '. Это может быть полезно в Клонирование ТА, посредством чего клонирование вектор (например, плазмида ), имеющий T (тимин ) 3 'выступ, который дополняет выступ A продукта ПЦР, что позволяет перевязка продукта ПЦР в плазмидный вектор.

В ПЦР

В начале 1980-х гг. Кэри Маллис работал на Cetus Corporation о применении синтетических ДНК для биотехнология. Он был знаком с использованием ДНК олигонуклеотиды в качестве зондов для связывания с целевыми цепями ДНК, а также их использование в качестве грунтовки за Секвенирование ДНК и кДНК синтез. В 1983 году он начал использовать два праймера, один для гибридизировать к каждой цепи целевой ДНК и добавив ДНК-полимераза на реакцию. Это привело к экспоненциальному Репликация ДНК,[11] значительно усиливают дискретные сегменты ДНК между праймерами.[3]

Однако после каждого цикла репликации смесь необходимо нагреть выше 90 ° C до денатурировать вновь сформированная ДНК, позволяющая цепям разделиться и действовать как матрица в следующем раунде амплификации. Эта стадия нагрева также инактивирует ДНК-полимеразу, которая использовалась до открытия Taq полимераза, Кленовский фрагмент (получено из Кишечная палочка ). Taq Полимераза хорошо подходит для этого применения, потому что она способна выдерживать температуру 95 ° C, которая требуется для разделения цепей ДНК без денатурации.

Использование термостабильного Taq позволяет проводить ПЦР при высокой температуре (~ 60 ° C и выше), что способствует высокой специфичности праймеров и снижает производство неспецифических продуктов, таких как димер праймера. Кроме того, использование термостабильной полимеразы избавляет от необходимости добавлять новый фермент в каждый цикл термоциклирования. Одиночная закрытая труба в относительно простой машина можно использовать для выполнения всего процесса. Таким образом, использование Taq полимераза была ключевой идеей, которая сделала ПЦР применимой к большому разнообразию молекулярная биология проблемы, касающиеся анализа ДНК.[2]

Патентные вопросы

Hoffmann-La Roche в итоге купил ПЦР и Taq патенты от Cetus за 330 миллионов долларов, из которых он мог получить до 2 миллиардов долларов роялти.[12] В 1989 г. Научный журнал названный Taq полимераза его первая "Молекула года ". Кэри Муллис получила Нобелевская премия по химии в 1993 г. - единственная награда за исследования, выполненные в биотехнология Компания. К началу 1990-х годов техника ПЦР с Taq полимераза используется во многих областях, включая фундаментальные исследования молекулярной биологии, клинические испытания, и криминалистика. Он также начал находить неотложное применение в прямом обнаружении ВИЧ в СПИД.[13]

В декабре 1999 г. окружной судья США Вон Уокер постановил, что патент 1990 г. Taq Полимераза была частично выпущена на основании вводящей в заблуждение информации и ложных утверждений ученых с Cetus Corporation. Решение поддержало вызов Корпорация Промега против Хоффман-Ла Рош, который приобрел Taq патентов в 1991 году. Судья Уокер сослался на предыдущие открытия, сделанные другими лабораториями, включая лабораторию профессора Джон Трела в Университет Цинциннати отдел биологических наук, как основание для постановления.[14]

Структура домена

Полимераза Taq, экзонуклеаза
Taq.png
Полный Taq ДНК-полимераза, связанная с октамером ДНК
Идентификаторы
СимволTaq-exonuc
PfamPF09281
ИнтерПроIPR015361
SCOP21qtm / Объем / СУПФАМ

Taq PolA имеет общую структуру, аналогичную структуре Кишечная палочка PolA. Средний 3'-5'-домен экзонуклеазы, отвечающий за корректуру, был радикально изменен и не работает.[15] Он имеет функциональный 5'-3'-экзонуклеазный домен на амино-конце, описанный ниже. Остальные два домена действуют согласованно посредством движения связанных доменов.[16]

Экзонуклеазный домен

Taq полимеразная экзонуклеаза является доменом на амино-конце Taq ДНК полимераза Я (термостабильный). Предполагается рибонуклеаза H-как мотив. Домен дает 5 '-3' экзонуклеаза активность к полимеразе.[17]

В отличие от того же домена в Кишечная палочка, которые разрушают праймеры и должны быть удалены путем расщепления для использования ПЦР,[9] не говорят, что этот домен разрушает праймер.[18] Это действие используется в TaqMan зонд: по мере образования дочерних цепей зонды, комплементарные матрице, входят в контакт с полимеразой и расщепляются на флуоресцентные части.[19]

Связывание с ДНК

Taq полимераза связывается в своей щели в активном центре полимеразы с тупым концом дуплексной ДНК. Поскольку Taq полимераза находится в контакте со связанной ДНК, ее боковые цепи образуют водородные связи с пуринами и пиримидинами ДНК. Тот же регион Taq полимераза, связанная с ДНК, также связывается с экзонуклеазой. Эти структуры связаны с Taq полимеразы имеют разные взаимодействия.

Мутанты

А сайт-направленный мутагенез Сообщалось об эксперименте, который увеличивает активность исследуемой 3'-5 'экзонуклеазы в 2 раза, но никогда не сообщалось, снижает ли это количество ошибок.[20] Следуя аналогичной линии мысли, химерные белки были получены путем сбора доменов вишни из Кишечная палочка, Taq, и T. neapolitana полимеразы I. Замена рудиментарного домена на функциональный из Кишечная палочка создали белок с возможностью корректуры, но с более низкой оптимальной температурой и низкой термостабильностью.[21]

Были получены версии полимеразы без 5'-3'-экзонуклеазного домена, среди которых Клентак или Stoffel фрагмент наиболее известен. Полное отсутствие экзонуклеазной активности делает эти варианты подходящими для праймеров, которые проявляют вторичную структуру, а также для копирования кольцевых молекул.[9] Другие варианты включают использование Клентак с высококачественной полимеразой, Термосеквеназа который распознает такие субстраты, как ДНК-полимераза Т7 делает, мутанты с более высокой толерантностью к ингибиторам или версии с "доменными тегами", которые имеют дополнительный спираль-шпилька-спираль вокруг каталитического сайта для более плотного удержания ДНК, несмотря на неблагоприятные условия.[22]

Taq Полимераза

Значение в обнаружении болезней

Из-за улучшений Taq полимераза, обеспечиваемая при репликации ДНК ПЦР: более высокая специфичность, меньшее количество неспецифических продуктов и более простые процессы и оборудование, она сыграла важную роль в усилиях по обнаружению заболеваний. «Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний привело к возможности ранней диагностики и надлежащего лечения заболеваний, вызванных привередливыми патогенами, определения чувствительности к противомикробным препаратам медленно растущих организмов и определения количества инфекции». [23] Реализация Taq полимераза спасла бесчисленное количество жизней. Он сыграл важную роль в выявлении многих самых страшных заболеваний в мире, включая туберкулез, стрептококковый фарингит, атипичную пневмонию, СПИД, корь, гепатит и язвенные урогенитальные инфекции. ПЦР, метод, используемый для воссоздания копий конкретных образцов ДНК, делает возможным обнаружение заболеваний за счет нацеливания на конкретную последовательность ДНК целевого патогена из образца пациента и увеличения следовых количеств индикативных последовательностей путем их копирования до миллиардов раз. Хотя это наиболее точный метод выявления заболеваний, особенно ВИЧ, он не выполняется так часто, как альтернативные, более низкие тесты из-за относительно высокой стоимости, трудозатрат и времени.[24]

Опора на Taq Полимераза как катализатор процесса репликации ПЦР была подчеркнута во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Нехватка необходимого фермента ограничила способность стран во всем мире производить тест-наборы для вируса. Без Taq полимеразы, процесс обнаружения болезни намного медленнее и утомителен.[25]

Несмотря на преимущества использования Taq полимераза в обнаружении болезней ПЦР, фермент не лишен своих недостатков. Ретровирусные заболевания: ВИЧ, HTLV-1 и HTLV-II; часто включают в свой геном мутации от гуанина до аденина. Подобные мутации позволяют тестам ПЦР выявлять заболевания, но Taq Относительно низкая верность полимеразы приводит к возникновению такой же мутации G-to-A и, возможно, к ложноположительному результату теста.[26]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Чиен А., Эдгар Д. Б., Трела Дж. М. (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из экстремального термофила Thermus aquaticus». Журнал бактериологии. 127 (3): 1550–7. Дои:10.1128 / jb.127.3.1550-1557.1976. ЧВК  232952. PMID  8432.
  2. ^ а б Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (Январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука. 239 (4839): 487–91. Bibcode:1988Научный ... 239..487С. Дои:10.1126 / science.239.4839.487. PMID  2448875.[постоянная мертвая ссылка ]
  3. ^ а б Сайки Р.К., Шарф С., Фалуна Ф., Маллис КБ, Хорн Г.Т., Эрлих Х.А., Арнхейм Н. (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука. 230 (4732): 1350–4. Bibcode:1985Научный ... 230.1350S. Дои:10.1126 / science.2999980. PMID  2999980. Архивировано из оригинал 19 декабря 2008 г.
  4. ^ а б Адвокат ФК, Стоффель С., Сайки Р.К., Чанг С.И., Ландре П.А., Абрамсон Р.Д., Гельфанд Д.Х. (май 1993 г.). «Высокий уровень экспрессии, очистки и ферментативной характеристики полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы с недостаточностью экзонуклеазной активности от 5 'до 3'». Методы и приложения ПЦР. 2 (4): 275–87. Дои:10.1101 / gr.2.4.275. PMID  8324500.
  5. ^ Протоколы ПЦР: руководство по методам и применению. Innis, Майкл А. Сан-Диего: Academic Press. 1990 г. ISBN  978-0123721808. OCLC  19723112.CS1 maint: другие (связь)
  6. ^ Технология ПЦР: принципы и приложения для амплификации ДНК. Эрлих, Генри А., 1943-. Нью-Йорк: Стоктон Пресс. 1989 г. ISBN  978-0333489482. OCLC  19323242.CS1 maint: другие (связь)
  7. ^ Лопата А., Йохарт Б., Сураньи Э.В., Такач Э., Безур Л., Левелес I и др. (Октябрь 2019 г.). «Помимо хелатирования: EDTA прочно связывает ДНК-полимеразу Taq, MutT и dUTPase и напрямую подавляет активность dNTPase». Биомолекулы. 9 (10): 621. Дои:10.3390 / biom9100621. ЧВК  6843921. PMID  31627475.
  8. ^ Тиндалл К.Р., Кункель Т.А. (август 1988 г.). «Верность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия. 27 (16): 6008–13. Дои:10.1021 / bi00416a027. PMID  2847780.
  9. ^ а б c ван Пелт-Веркуил Э, ван Белкум А, Хейс JP (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты амплификации ПЦР. С. 103–18. Дои:10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN  978-1-4020-6240-7.
  10. ^ Брандарис-Фонтес С., Камачо-Санчес М., Вила С., Вега-Пла Ю.Л., Рико С., Леонард Дж. А. (январь 2015 г.). «Влияние фермента и условий ПЦР на качество результатов высокопроизводительного секвенирования ДНК». Научные отчеты. 5: 8056. Bibcode:2015НатСР ... 5Э8056Б. Дои:10.1038 / srep08056. ЧВК  4306961. PMID  25623996.
  11. ^ Mullis KB (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Scientific American. 262 (4): 56–61, 64–5. Bibcode:1990SciAm.262d..56M. Дои:10.1038 / scientificamerican0490-56. PMID  2315679.
  12. ^ Фор Дж., Вичерс И.Р., Кук-Диган Р. (июль 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на развитие и распространение полимеразной цепной реакции: тематическое исследование». Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества. 1: 7. Дои:10.1186/1747-5333-1-7. ЧВК  1523369. PMID  16817955.
    Подробная история Cetus Corporation и коммерческие аспекты PCR.
  13. ^ Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (апрель 1989 г.). «Амплификация нуклеиновых кислот in vitro: обнаружение последовательностей с низким числом копий и применение для диагностики инфекции вируса иммунодефицита человека 1 типа». Обзоры клинической микробиологии. 2 (2): 217–26. Дои:10.1128 / CMR.2.2.217. ЧВК  358112. PMID  2650862.
  14. ^ Карран, Крис, Биомедицина, 7 декабря 1999 г.
  15. ^ Eom SH, Wang J, Steitz TA (июль 1996 г.). «Структура Taq-полимеразы с ДНК в активном центре полимеразы». Природа. 382 (6588): 278–81. Bibcode:1996Натура.382..278E. Дои:10.1038 / 382278a0. PMID  8717047.
  16. ^ Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (декабрь 2005 г.). «Движение связанного белкового домена в полимеразе Taq обнаружено с помощью нейтронной спин-эхо-спектроскопии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (49): 17646–51. Bibcode:2005PNAS..10217646B. Дои:10.1073 / pnas.0503388102. ЧВК  1345721. PMID  16306270.
  17. ^ Ли Ю., Митаксов В., Ваксман Г. (август 1999 г.). «Дизайн на основе структуры ДНК-полимераз Taq с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96 (17): 9491–6. Bibcode:1999PNAS ... 96.9491L. Дои:10.1073 / пнас.96.17.9491. ЧВК  22236. PMID  10449720.
  18. ^ «Будет ли 5 ​​'→ 3' эндонуклеазная активность Taq ДНК-полимеразы разлагать праймеры?». NEB. Получено 28 марта 2019.
  19. ^ Экспрессия гена TaqMan - проекты NCBI
  20. ^ Пак И, Чой Х, Ли Д.С., Ким И (июнь 1997 г.). «Улучшение 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq с помощью белковой инженерии в активном центре». Молекулы и клетки. 7 (3): 419–24. PMID  9264032.
  21. ^ Виллбрандт Б., Собек Х., Фрей Б., Шомбург Д. (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana». Белковая инженерия. 13 (9): 645–54. Дои:10.1093 / белок / 13.9.645. PMID  11054459.
  22. ^ Ишино С., Ишино Ю. (2014). «ДНК-полимеразы как полезные реагенты для биотехнологии - история развития исследований в этой области». Границы микробиологии. 5: 465. Дои:10.3389 / fmicb.2014.00465. ЧВК  4148896. PMID  25221550.
  23. ^ Менон П.К., Капила К., Охри В.К. (июль 1999 г.). «Полимеразная цепная реакция и достижения в диагностике инфекционных заболеваний». Медицинский журнал, Вооруженные силы Индии. 55 (3): 229–231. Дои:10.1016 / S0377-1237 (17) 30450-1. ЧВК  5531883. PMID  28775636.
  24. ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)». stanfordhealthcare.org. Получено 2020-04-23.
  25. ^ «Глава FDA предупреждает о« давлении »поставок реагентов для тестов на коронавирус». MedTech Dive. Получено 2020-04-23.
  26. ^ Овербо Дж., Джексон С.М., Папенхаузен, доктор медицины, Руденси Л.М. (ноябрь 1996 г.). «Лентивирусные геномы с гипермутацией G-to-A могут быть результатом ошибок полимеразы Taq во время полимеразной цепной реакции». Исследования СПИДа и ретровирусы человека. 12 (17): 1605–13. Дои:10.1089 / помощь.1996.12.1605. PMID  8947295.