История полимеразной цепной реакции - History of polymerase chain reaction

Основная статья: Полимеразной цепной реакции
(В этой статье предполагается, что вы знакомы с терминами и компонентами, используемыми в процессе ПЦР.)
Структура ДНК.
Репликация ДНК.
ДНК-полимераза I (PDB).
Молекулярный механизм ПЦР.
Полоска из восьми пробирок для ПЦР.

В история полимеразной цепной реакции (ПЦР) по-разному описывается как классический "Эврика!" момент[1] или как пример совместной работы разрозненных исследователей.[2] Ниже приводится список событий до, во время и после его развития:

Прелюдия

  • На 25 апреля 1953 г. Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовал «кардинально иную структуру» для ДНК,[3] тем самым основав область молекулярная генетика. Их структурная модель показал две нити дополнительный базовая пара ДНК, бегущая в противоположных направлениях в виде двойной спирали. Они завершили свой отчет, сказав, что «Мы не ускользнули от нашего внимания, что определенная пара, которую мы постулировали, сразу же предполагает возможный механизм копирования генетического материала». За это понимание они были награждены Нобелевская премия в 1962.
  • Начиная с середина 1950-х, Артур Корнберг начал изучать механизм Репликация ДНК.[4] К 1957 он определил первый ДНК-полимераза.[5] Фермент был ограничен, создавая ДНК только в одном направлении и требуя существующего грунтовка чтобы инициировать копирование нити шаблона. В целом, процесс репликации ДНК на удивление сложен и требует отдельных белков для открыто спираль ДНК, чтобы держать он открыт, чтобы создать грунтовки, к синтезировать новая ДНК, чтобы удалять грунтовки и галстук все вместе. Корнберг был награжден Нобелевская премия в 1959.
  • в начало 1960-х Х. Гобинд Хорана добились значительных успехов в разъяснении генетический код. Впоследствии он инициировал большой проект по полностью синтезировать функциональный человек ген.[6] Чтобы добиться этого, Хорана впервые применил многие техники, необходимые для создания и использования синтетический ДНК олигонуклеотиды. Последовательно-специфические олигонуклеотиды использовали как строительные блоки для гена, так и в качестве праймеров и матриц для ДНК-полимеразы. В 1968 Хорана была награждена Нобелевская премия за его работу над Генетическим кодом.
  • В 1969 Томас Д. Брок сообщили об изоляции нового вида бактерия из горячий источник в Йеллоустонский Национальный Парк. Thermus aquaticus[7] (Taq), стал стандартным источником ферментов, способных выдерживать более высокие температуры, чем E. Coli.
  • В 1970 Кленов сообщил о модифицированной версии ДНК-полимеразы I из Кишечная палочка.[8] Обработка протеазой устраняла «прямую» нуклеазную активность этого фермента. Общая активность полученного Кленовский фрагмент поэтому склоняется к синтезу ДНК, а не к ее деградации.
  • К 1971 Исследователи проекта Хорана, обеспокоенные выходом ДНК, начали изучать «репарационный синтез» - искусственную систему праймеров и матриц, которая позволяет ДНК-полимеразе копировать сегменты синтезируемого ими гена. Хотя схожесть с ПЦР в использовании повторных применений ДНК-полимеразы, процесс, который они обычно описывают[9] использует только один комплекс праймер-матрица и, следовательно, не приведет к экспоненциальной амплификации, наблюдаемой в ПЦР.
  • Около 1971 Кьелл Клеппе, исследователь лаборатории Хораны, представил процесс, очень похожий на ПЦР. В конце статьи о более ранней технике[10] он описал, как система с двумя праймерами может привести к репликации определенного сегмента ДНК:
«можно было бы надеяться получить две структуры, каждая из которых содержит полную длину цепи матрицы, надлежащим образом образованную с праймером. ДНК-полимераза будет добавлена ​​для завершения процесса репликации репарации. В результате должны получиться две молекулы исходного дуплекса. Весь цикл может быть повторять, добавляя каждый раз новую дозу фермента ». [10]
Никаких результатов там не показано, а упоминание неопубликованных экспериментов в другой статье[9] может (или не может) относиться к системе репликации с двумя праймерами. (Эти ранние предшественники ПЦР были тщательно изучены в патентном иске и обсуждаются в главах Маллиса в Полимеразная цепная реакция (1994).[11])
  • Также в 1971, Cetus Corporation была основана в Беркли, Калифорния Рональда Кейпа, Питера Фарли и Дональда Глезера. Первоначально компания провела скрининг на микроорганизмы, способные производить компоненты, используемые в производстве продуктов питания, химикатов, вакцин или фармацевтических препаратов. После переезда в соседний Emeryville, они начали проекты с участием новых биотехнология промышленность, прежде всего клонирование и выражение человеческих генов, но также и разработка диагностических тестов на генетические мутации.
  • В 1976 а ДНК-полимераза[12] был изолирован от T. aquaticus. Было обнаружено, что он сохраняет свою активность при температурах выше 75 ° C.
  • В 1977 Фредерик Сэнгер сообщил о метод для определения последовательности ДНК.[13] В методике использовался олигонуклеотид. грунтовка, ДНК-полимераза и модифицированная предшественники нуклеотидов которые блокируют дальнейшее удлинение праймера в зависимости от последовательности. За это нововведение он был награжден Нобелевская премия в 1980.

К 1980 все компоненты, необходимые для выполнения ПЦР-амплификации, были известны научному сообществу. Использование ДНК-полимеразы для удлинения олигонуклеотидных праймеров было распространенной процедурой при секвенировании ДНК и получении кДНК за клонирование и выражение. Использование ДНК-полимеразы для ник перевод был наиболее распространенным методом маркировки ДНК-зонды за Саузерн-блоттинг.

Тема

  • В 1979 Cetus Corporation принят на работу Кэри Маллис синтезировать олигонуклеотиды для различных исследовательских и опытно-конструкторских проектов всей компании.[14] Эти олигонуклеотиды использовали в качестве зондов для скрининга клонированных генов, в качестве праймеров для секвенирования ДНК и синтеза кДНК, а также в качестве строительных блоков для конструирования генов. Первоначально синтезируя эти олигонуклеотиды вручную, Муллис позже оценил ранние прототипы автоматических синтезаторов.[1]
  • К Май 1983 г. Муллис синтезировал олигонуклеотидные зонды для проекта Cetus по анализу серповидноклеточная анемия мутация. Услышав о проблемах с их работой, Маллис предложил альтернативную технику, основанную на методе Сэнгера. Секвенирование ДНК метод.[14] Понимая, насколько сложно сделать метод Сэнгера специфичным для одного места в геноме, Маллис изменил идею, добавив второй праймер на противоположной цепи. Повторные применения полимеразы могут привести к цепной реакции репликации для определенного сегмента генома - ПЦР.
  • Позже 1983 Муллис начал проверять свою идею. Его первый эксперимент[2] не включал термоциклирование - он надеялся, что полимераза сможет выполнять непрерывную репликацию самостоятельно. Более поздние эксперименты в том же году включали повторные термоциклы и нацелены на небольшие сегменты клонированного гена. Муллис считал эти эксперименты успешными, но не смог убедить других исследователей.
  • В Июнь 1984 г. Cetus провел свое ежегодное собрание в Монтерей, Калифорния. Его ученые и консультанты представили свои результаты и рассмотрели будущие проекты. Муллис представил плакат о производстве олигонуклеотидов в своей лаборатории и представил некоторые результаты своих экспериментов с ПЦР.[2] Только Джошуа Ледерберг, консультант Cetus, проявил интерес.[14] Позже на встрече Муллис был вовлечен в физическую ссору с другим исследователем Cetus из-за спора, не связанного с PCR.[2] Другой ученый покинул компанию, и Муллис был снят с должности главы лаборатории синтеза олигонуклеотидов.

Разработка

  • В Сентябрь 1984 г. Том Уайт, Вице-президент из Cetus (и его близкий друг) заставили Маллиса передать его идею группе, разрабатывающей анализ генетической мутации. Вместе они потратили следующие месяцы на разработку экспериментов, которые могли бы убедительно показать, что ПЦР работает с геномной ДНК. К сожалению, ожидаемый продукт амплификации не был виден в электрофорез в агарозном геле,[15] приводя к путанице относительно того, имела ли реакция какую-либо специфичность для целевой области.
  • В Ноябрь 1984 г.[2] продукты амплификации анализировали Саузерн-блоттинг, что наглядно демонстрирует рост ожидаемых 110 бп Продукт ДНК.[16] Получив первый видимый сигнал, исследователи начали оптимизацию процесса. Позже амплифицированные продукты были клонированы и секвенированы, что показало, что только небольшая часть амплифицированной ДНК является желаемой мишенью и что Кленовский фрагмент тогда используемые лишь изредка включают неправильные нуклеотиды во время репликации.[15]

Экспозиция

  • Следуя обычной производственной практике, Маллис применил [17] для патент охватывала основную идею ПЦР и многие потенциальные приложения, и его спросили ВОМ чтобы включить больше результатов. На 28 марта 1985 г. Группа разработчиков Маллиса подала заявку[18] сосредоточены на анализе мутации серповидноклеточной анемии с помощью ПЦР и Ограничение олигомера. После внесения изменений оба патента были утверждены на 28 июля 1987 г..
  • в весна 1985 г. группа разработчиков начала применять технику ПЦР для других целей. Праймеры и зонды были разработаны для вариабельного сегмента Лейкоцитарный антиген человека DQα ген. Эта реакция была намного более специфичной, чем реакция для мишени β-гемоглобина - ожидаемого продукта ПЦР.[15] непосредственно виден на электрофорез в агарозном геле. Продукты амплификации из различных источников также были клонированы и секвенированы, первое определение новых аллелей с помощью ПЦР.[15] В то же время оригинальный метод анализа рестрикции олигомеров был заменен на более общий Аллель-специфический олигонуклеотид метод.[19]
  • Также в начале 1985 годагруппа начала использовать термостабильную ДНК-полимеразу ( фермент использованный в исходной реакции, разрушается на каждой стадии нагрева). В то время[1] были описаны только два из Taq и Bst. Отчет о Taq-полимеразе[12] был более подробным, поэтому был выбран для тестирования. Позже было обнаружено, что полимераза Bst не подходит для ПЦР.[нужна цитата ]. Тем летом Муллис попытался выделить фермент, и группа за пределами Кита была нанята, чтобы сделать это, но безуспешно. в Осень 1985 г. Сюзанна Стоффель и Дэвид Гельфанд из Cetus преуспели в создании полимеразы, и Рэнди Сайки сразу же нашел ее для поддержки процесса ПЦР.
  • После подачи патентов была продолжена работа по сообщению ПЦР широкому научному сообществу. Резюме для Американское общество генетики человека встреча в Солт-Лейк-Сити был представлен в Апрель 1985 г., и первое объявление о PCR было сделано Сайки в Октябрь.[20] Были запланированы две публикации - документ с «идеей» от Маллиса и документ о «применении» от всей группы разработчиков. Муллис отправил свою рукопись в журнал Природа, который отклонил его из-за отсутствия результатов. Другой документ, в основном описывающий ИЛИ ЖЕ анализ пробирный, был представлен Наука на 20 сентября 1985 г. и был принят в ноябре. После отклонения отчета Муллиса в декабре подробности процесса PCR были поспешно добавлены во второй документ, который появляется на 20 декабря 1985 г..[16]
  • В Май 1986 г. Муллис представил PCR на симпозиуме в Колд-Спринг-Харбор,[21] и гораздо позже опубликовал модифицированную версию своей первоначальной «идейной» рукописи.[22] Первый отчет не Cetus с использованием ПЦР был отправлен 5 сентября 1986 г.,[23] показывая, как быстро другие лаборатории начали внедрять эту технику. Группа разработчиков Cetus опубликовала подробный анализ последовательности продуктов ПЦР на 8 сентября 1986 г.,[15] и их использование ASO зонды на 13 ноября 1986 г..[19]
  • Генри Эрлих объявил об использовании Taq-полимеразы в ПЦР. встреча в Берлине на 20 сентября 1986 г., представлен для публикации в Октябрь 1987 г., и был опубликован в начале следующего года ».[24] Патент на ПЦР с Taq-полимеразой был подан 17 июня 1987 г., и был выпущен 23 октября 1990 г..[25]

Вариация

  • В Декабрь 1985 г. совместное предприятие Cetus и Перкин-Элмер была создана для разработки инструментов и реагентов для ПЦР. Сложный Термоциклеры были созданы для выполнения усилений на основе Кленова, но никогда не поступали в продажу. Были разработаны более простые машины для ПЦР на основе Taq, и на 19 ноября 1987 г. в пресс-релизе сообщается о коммерческой доступности "термоциклера PCR-1000" и "ДНК-полимеразы AmpliTaq".
  • в Весна 1985 г. Джон Снински из Cetus начал использовать ПЦР для решения сложной задачи измерения количества ВИЧ, циркулирующего в крови. Жизнеспособный тест был объявлен 11 апреля 1986 г., и опубликовано в Май 1987 г..[26] Затем сданная кровь может быть проверена на наличие вируса и непосредственно отслеживаться действие противовирусных препаратов.
  • В 1985 Норм Арнхейм, также член команды разработчиков, завершил свой творческий отпуск в Cetus и занял академическую должность в USC. Он начал исследовать использование ПЦР для амплификации образцов, содержащих только одну копию целевой последовательности. К 1989 его лаборатория разработала мультиплексную ПЦР на отдельных сперматозоидах для непосредственного анализа продуктов мейотической рекомбинации.[27] Эти однокопийные амплификации, которые впервые были проведены во время характеристики полимеразы Taq,[24] стал жизненно важным для изучения древняя ДНК, а также генетическое типирование предварительно имплантированных эмбрионов.
  • В 1986 Эдвард Блейк, судебно-медицинский эксперт, работающий в здании Cetus, сотрудничал с Генри Эрлихом, исследователем из Cetus, чтобы применить метод PCR к анализу улик. Панель образцов ДНК из старых случаев была собрана, закодирована и проанализирована Сайки вслепую с использованием анализа HLA DQα. Когда код был взломан, все улики и преступники совпали. Группа Блейка и Эрлиха почти сразу применила эту технику в деле «Пенсильвания против Пестиникас»,[28] первое применение МКП в уголовном деле. Этот тест DQα разработан Cetus как один из их наборов «Ampli-Type» и стал частью ранних протоколов для тестирования судебно-медицинских доказательств, таких как Дело об убийстве О. Дж. Симпсона.
  • К 1989 Алек Джеффрис, которые ранее разработали и применили первые Снятие отпечатков ДНК тесты, использовали ПЦР для повышения их чувствительности.[29] При дальнейшей модификации амплификация высокополиморфных ВНТР loci стал стандартным протоколом для Национальные базы данных ДНК Такие как CODIS.
  • В 1987 Руссу Хигучи удалось усилить ДНК человеческого волоса.[30] Эта работа была расширена для разработки методов амплификации ДНК из сильно деградированных образцов, например из Древняя ДНК И в судебно-медицинский свидетельство.

Coda

  • На 22 декабря 1989 г. Журнал Наука присудил Taq Polymerase (и PCR) награду «Молекула года». Бумага Taq PCR[24] стал за несколько лет самым цитируется издание по биологии.
  • После публикации первой статьи ПЦР[16] то Правительство США отправил суровое письмо Рэнди Сайки, в котором упрекнул его за публикацию отчета о "цепные реакции" без необходимого предварительного рассмотрения и утверждения со стороны Министерство энергетики США. Cetus ответил, объяснив различия между ПЦР и Атомная бомба.[нужна цитата ]
  • На 23 июля 1991 г. Cetus объявила о продаже соседней биотехнологической компании. Хирон. В рамках продажи права на патенты PCR были проданы за 300 миллионов долларов США компании Хоффман-Ла Рош (кто в 1989 купил ограниченные права на МКП). Многие исследователи Cetus PCR перешли в дочернюю компанию Roche, Молекулярные системы Рош.
  • На 13 октября 1993 г. Кэри Маллис, который оставил Кита в 1986был награжден Нобелевская премия по химии. Утром в день его благодарственной речи[1] Шведские власти едва не арестовали его за «ненадлежащее использование лазерной указки».[31]

Рекомендации

  1. ^ а б c d Нобелевская лекция Кэри Маллис, 8 декабря 1993 г.
  2. ^ а б c d е Rabinow P "Making PCR: A Story of Biotechnology" University of Chicago Press (1996) ISBN  0-226-70147-6
  3. ^ Watson JD, Crick FHC "Структура нуклеиновой кислоты дезоксирибозы", Nature vol. 171. С. 737–738 (1953). [1]
  4. ^ (Открытие Артуром Корнбергом ДНК-полимеразы I) J. Biol. Chem. т. 280, стр. 46. [2]
  5. ^ Lehman, IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A "Ферментативный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты. I. Получение субстратов и частичная очистка фермента из Escherichia coli" J. Biol. Chem. т. 233 (1), стр. 163–170 (1958).
  6. ^ Khorana HG et al. «Полный синтез структурного гена предшественника РНК-переносчика тирозина-супрессора из Escherichia coli. 1. Общее введение» J. Biol. Chem. т. 251 (3) стр. 565–70 (1976).
  7. ^ Брок Т.Д., Фриз H "Thermus aquaticus, неспорообразующий крайний термофил" J. Bacteriol. т. 98 (1) стр. 289–297 (1969).
  8. ^ Klenow H и Henningsen I. «Избирательное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B с помощью ограниченного протеолиза» Proc Natl Acad Sci vol. 65 с. 168–75 (1970).
  9. ^ а б Панет А., Хорана Х. Г. «Исследования полинуклеотидов» J. Biol. Chem. т. 249 (16), стр. 5213–21 (1974).
  10. ^ а б Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG «Исследования полинуклеотидов. XCVI. Восстановление репликаций коротких синтетических ДНК, катализируемых ДНК-полимеразами». J. Molec. Биол. т. 56, стр. 341–61 (1971).
  11. ^ Муллис К.Б., Ферре Ф., Гиббс Р.А. "Полимеразная цепная реакция" Birkhäuser Press (1994) ISBN  0-8176-3750-8
  12. ^ а б Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM "Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из чрезвычайно термофильного Thermus aquaticus" J. Bacteriol. т. 174 с. 1550–1557 (1976).
  13. ^ Sanger F, Nicklen S, Coulson AR "Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи" Proc Natl Acad Sci vol. 74 (12) стр. 5463–7 (1977).
  14. ^ а б c Муллис К.Б. "Необычное происхождение полимеразной цепной реакции" Scientific American, vol. 262, стр. 56–65 (апрель 1990 г.).
  15. ^ а б c d е Шарф и др. "Прямое клонирование и анализ последовательности ферментативно амплифицированных геномных последовательностей" Science vol. 233, стр. 1076–78 (1986).
  16. ^ а б c Сайки Р.К. и др. "Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидной анемии" Science vol. 230 с. 1350–54 (1985).
  17. ^ Mullis KB "Процесс амплификации последовательностей нуклеиновых кислот". Патент США 4683202 .
  18. ^ Mullis, KB et al. «Процесс амплификации, обнаружения и / или клонирования последовательностей нуклеиновых кислот». Патент США 4683195 .
  19. ^ а б Сайки и др. «Анализ ферментативно амплифицированной ДНК β-глобина и HLA DQα с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами». Nature vol. 324 (6093), стр. 163–6 (1986).
  20. ^ Saiki, R et al. «Новый метод пренатальной диагностики серповидноклеточной анемии» Amer. Soc. Human Genetics, 9–13 октября 1985 г.
  21. ^ Mullis KB et al. «Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro: полимеразная цепная реакция». Холодный источник Харб. Symp. Quant. Биол. т. 51 с. 263–73 (1986).
  22. ^ Mullis KB и Faloona FA "Специфический синтез ДНК in vitro посредством цепной реакции, катализируемой полимеразой". Методы в энзимологии vol. 155 (F), стр. 335–50 (1987).
  23. ^ Verlaan-de Vries M et al. «Процедура дот-блоттинга для выявления мутировавших онкогенов ras с использованием синтетических олигодезоксинуклеотидов». Gene vol. 50 (1–3) стр. 313–20 (1986).
  24. ^ а б c Сайки и др. «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Science vol. 239 с. 487–91 (1988).
  25. ^ Mullis, KB et al. «Процесс амплификации, обнаружения и / или клонирования последовательностей нуклеиновых кислот с использованием термостабильного фермента». Патент США 4965188 .
  26. ^ Kwok S et al. «Идентификация последовательностей ВИЧ с использованием ферментативной амплификации in vitro и обнаружения расщепления олигомеров». J. Virol. т. 61 (5) pp. 1690–4 (1987).
  27. ^ Boehnke M et al. «Тонкоструктурное генетическое картирование хромосом человека с использованием полимеразной цепной реакции на отдельных сперматозоидах». Am J Hum Genet об. 45 (1) стр. 21–32 (1989).
  28. ^ «Хронология судебной медицины (PDF)» (PDF). Архивировано из оригинал (PDF) на 2008-07-09. Получено 2008-04-12.
  29. ^ Jeffreys A et al. «Усиление человеческих мини-спутников». Nucleic Acids Research vol. 23 с. 10953-71 (1988).
  30. ^ Higuchi R et al. «Типирование ДНК по единичным волоскам». Nature vol. 332 (6164), стр. 543–6 (1988).
  31. ^ Муллис К. Б. "Танцы обнаженными в поле разума" Книги Пантеона (1998) ISBN  0-679-44255-3