Обратное северное пятно - Reverse northern blot

В обратный северный блот представляет собой метод, с помощью которого можно анализировать паттерны экспрессии генов, сравнивая изолированные молекулы РНК из тестируемого образца с образцами из контрольной библиотеки кДНК. Это вариант северное пятно в котором нуклеиновая кислота, иммобилизованная на мембране, представляет собой набор изолированных ДНК фрагменты, а не РНК, а зонд РНК, извлеченная из ткани и радиоактивно меченная. Обратный нозерн-блот можно использовать для профилирования уровней экспрессии определенных наборов последовательностей РНК в ткани или для определения присутствия конкретной последовательности РНК в образце.[1] Хотя ДНК-микрочипы и новые методы следующего поколения в основном вытеснили обратный нозерн-блоттинг, он все еще используется сегодня и обеспечивает относительно дешевый и простой способ определения экспрессии больших наборов генов.

Процедура

Чтобы получить обратную северную мембрану, последовательности кДНК для представляющих интерес транскриптов иммобилизуют на нейлоновых мембранах, что может быть выполнено с помощью дот-блоттинга или двунаправленного блоттинга на агарозном геле и УФ-фиксации ДНК на мембранах. Во многих случаях зонды кДНК могут быть предпочтительнее зондов РНК, чтобы смягчить проблемы деградации РНК РНКазами или тканевыми метаболитами.[2] Подготовленные мембраны обратного нозерн-блоттинга предварительно гибридизируют в растворе Денхардта с буфером SSC, а меченые кДНК-зонды денатурируют при 100 ° C и добавляют в раствор для предварительной гибридизации. Мембрану инкубируют с зондами не менее 15 часов при 65 ° C, затем промывают и экспонируют.[3]

Приложения

Количественная оценка уровней экспрессии мРНК

Общая процедура обратного нозерн-блоттинга с использованием кДНК из тестируемого образца и SSH библиотека. Сверхэкспрессия транскриптов в образце тестера будет отображаться в виде более темных точек на мембране.

Обратный Нозерн-блоттинг, как и Нозерн-блот, на котором он основан, используется для определения уровней экспрессии генов в конкретных тканях. По сравнению с Нозерн-блоттингом, обратный Нозерн-блот позволяет одновременно зондировать большое количество транскриптов с меньшей специфичностью в отношении зондов, чем это требуется для Нозерн-блоттинга.[4] Часто это связано с использованием подавление субтрактивной гибридизации (SSH) библиотеки или дифференциальный дисплей для выделения дифференциально экспрессируемых транскриптов и создания бактериальных клонов, содержащих вставки для этих последовательностей. Они будут служить мишенями, гибридизованными с мембраной, и будут зондироваться образцом РНК. Уровни экспрессии можно количественно определить по увеличению или уменьшению флуоресцентного или радиоактивного сигнала по сравнению с контрольной обработкой.[3] Полосы или точки, которые кажутся более темными и крупными, означают транскрипты, которые чрезмерно экспрессируются в интересующем образце, а более светлые точки указывают на то, что транскрипт снижается по сравнению с контрольным образцом.

Подтверждение результатов дифференциального отображения

Из-за тенденции генерировать большое количество ложных срабатываний, вызванных загрязнением полосы гетерогенными последовательностями, совпадения дифференциального отображения должны быть подтверждены альтернативным методом определения дифференциальной экспрессии.[5] Пока северный блот или q-ПЦР часто используются для подтверждения результатов, у обоих методов есть недостатки. Нозерн-блоттинг ограничен своей способностью исследовать только одну мРНК за раз, в то время как q-ПЦР требует, чтобы транскрипты были достаточно длинными, чтобы генерировать праймеры для последовательности, а зонды могут быть дорогостоящими. Таким образом, обратный северный был использован в качестве одного из средств подтверждения совпадений из DD-PCR или последовательностей с измененными уровнями экспрессии. В этом случае мембрана будет покрыта амплифицированными продуктами DD-PCR, которые были клонированы в векторы, секвенированы и повторно амплифицированы.[4]

ДНК-микрочипы

ДНК-микрочипы работают аналогично процедурам, используемым в обратном Нозерн-блоттинге, состоящем из множества ДНК-зондов, гибридизованных с твердой стеклянной, пластиковой или кремниевой подложкой, которая зондируется меченой РНК или кДНК. Это позволяет значительно расширить профилирование экспрессии генов.[6] Массивы могут быть приобретены у коммерческих поставщиков с учетом исследовательских потребностей, например микроматрицы рака, клеточного цикла или токсикологии, или могут быть созданы для индивидуальных целей.[7] Флуоресцентные или радиоактивные сигналы, генерируемые гибридизацией изолированных проб кДНК-зондов, будут пропорциональны распространенности транскрипта в исследуемой ткани.[8]

Приложения для исследований

  • Обратный нозерн-блоттинг был использован в исследовании 2013 г. Ген в котором автор идентифицировал ряд генов, ответственных за раннюю реакцию холодоустойчивости у холодостойких цитрусовых. Poncirus trifoliata. Библиотеки супрессивной субтрактивной гибридизации были сформированы из обработанных холодом и контрольных растений, и клоны кДНК были секвенированы и гибридизированы с мембраной, которую зондировали с помощью кДНК, меченной DIG, как из контрольных, так и из обработанных холодом растений. Гены, в которых наблюдалась особенно сильная активация, включали гены спасения и защиты клеток, клеточного метаболизма и регуляции транскрипции. К ним относятся активаза оксигеназы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, которая регулирует фотосинтетический фермент RuBisCO, GAPDH, который участвует в гликолизе и ответе на окислительный стресс, а также белок контроля деления клеток CDC91 и ген устойчивости к заболеванию NBS-LLR. Затем эти результаты были подтверждены методом количественной ПЦР.[9]
  • В исследовании использовался метод определения различий в полосатом теле у крыс, получавших 3-NP, который часто используется в экспериментах для создания фенотипа, подобного болезни Хантингтона, у крыс. Вычитающую гибридизацию с прямым и обратным подавлением использовали для создания профилей гена с повышенной и недостаточной экспрессией, и эти библиотеки использовали для блоттинга двух мембран. Помимо сходных проявлений поражений в препарированном мозге крысы, группа наблюдала значительно повышенную экспрессию профилина-2 (Pfn2) в полосатом теле. Его сверхэкспрессия связана с уменьшением полимеризации актина и, как следствие, более низкой плотностью дендритных шипов.[10]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Primrose, Sandy B .; Твайман, Ричард (2009-04-01). Принципы геномного анализа и геномики. Джон Вили и сыновья. ISBN  9781444311280.
  2. ^ Яакола, Лаура (2001). «КДНК-блоттинг предлагает альтернативный метод исследования экспрессии генов». Репортер по молекулярной биологии растений. 19 (2): 125–128. Дои:10.1007 / BF02772154.
  3. ^ а б Боулер, доктор Крис (2002-01-01). Молекулярная биология растений: практический подход. Издательство Оксфордского университета. ISBN  9780199638185.
  4. ^ а б Дилкс, Дэниел В; Кольцо, Роберт H; Khawaja, Xavier Z; Новак, Томас Дж; Астон, Кристофер (15 февраля 2003 г.). «Высокопроизводительное подтверждение результатов дифференциальной ПЦР с использованием обратного Нозерн-блоттинга». Журнал методов неврологии. 123 (1): 47–54. CiteSeerX  10.1.1.333.8554. Дои:10.1016 / S0165-0270 (02) 00343-6. PMID  12581848.
  5. ^ Callard, D .; Lescure, B .; Маццолини, Л. (1994). «Метод устранения ложных срабатываний, генерируемых методом дифференциального отображения мРНК». Биотехнологии. 16 (6): 1096–7, 1100–3. PMID  7521188.
  6. ^ Томар, Рукам С. (15.01.2010). Молекулярные маркеры и биотехнология растений. Издательство Новой Индии. ISBN  9789380235257.
  7. ^ Курназ, Исил Аксан (08.05.2015). Методы генной инженерии. CRC Press. ISBN  9781482260908.
  8. ^ Офферманнс, Стефан (14 августа 2008 г.). Энциклопедия молекулярной фармакологии. Springer Science & Business Media. ISBN  9783540389163.
  9. ^ Шахин-Чевик, Мехтап (10 января 2013 г.). «Идентификация и анализ экспрессии ранних индуцированных холодом генов холодостойких родственников цитрусовых Poncirus trifoliata (L.) Raf». Ген. 512 (2): 536–545. Дои:10.1016 / j.gene.2012.09.084. PMID  23026217.
  10. ^ Chakraborty, J .; Панди, М .; Navneet, A.K .; Appukuttan, T.A .; Varghese, M .; Sreetama, S.C .; Rajamma, U .; Моханакумар, К. (2014). «Профилин-2 увеличивал экспрессию и его измененное взаимодействие с β-актином в полосатом теле при болезни Хантингтона, вызванной 3-нитропропионовой кислотой, у крыс». Неврология. 281: 216–228. Дои:10.1016 / j.neuroscience.2014.09.035. PMID  25255934.

внешняя ссылка