ТИЛЛИНГ (молекулярная биология) - TILLING (molecular biology)

ОБРАБОТКА (Нацеливание на индуцированные локальные поражения в геномах) - метод в молекулярная биология что позволяет направленную идентификацию мутации в конкретном ген. TILLING была представлена ​​в 2000 году на модельном заводе Arabidopsis thaliana. С тех пор TILLING использовался как обратная генетика метод у других организмов, таких как данио, кукуруза, пшеница, рис, соя, помидор и латук.

Обзор

Метод сочетает в себе стандартную и эффективную технику мутагенез используя химический мутаген, такой как этилметансульфонат (EMS) с помощью чувствительной техники скрининга ДНК, которая выявляет одноосновные мутации (также называемые точечными мутациями) в целевом гене. Метод TILLING основан на формировании ДНК гетеродуплексы которые образуются, когда несколько аллелей усиливаются ПЦР а затем нагревают и медленно охлаждают. А “пузырь ”Образуется при несовпадении двух цепей ДНК, которая затем расщепляется одноцепочечной нуклеазы. Затем продукты разделяются по размеру на нескольких разных платформах (см. Ниже).

Несоответствия могут быть вызваны индуцированной мутацией, гетерозиготностью внутри человека или естественной изменчивостью между людьми.

ЭКОТИЛЛИНГ [1][2][3][4] это метод, использующий методы TILLING для поиска естественных мутаций у людей, обычно для анализа популяционной генетики. ДЕКОТИЛЛИНГ [5] представляет собой модификацию TILLING и EcoTILLING, в которой используется недорогой метод идентификации фрагментов. С появлением NGS секвенирование технологии, TILLING by-sequence[6] был разработан на основе секвенирования Illumina генов-мишеней, амплифицированных из многомерных объединенных шаблонов для выявления возможных однонуклеотидных изменений.

Ферменты одноцепочечного расщепления

Существует несколько источников однонитевых нуклеаз. Первый широко используемый фермент был нуклеаза маш, но было показано, что эта нуклеаза обладает высокой неспецифической активностью и работает только при низком pH, что может разрушать продукты ПЦР и праймеры, меченные красителем. Первоначальным источником однонитевой нуклеазы был CEL1 или CJE (экстракт сока сельдерея), но на рынок вышли и другие продукты, в том числе ферменты SNiPerase от Frontier Genomics, которые были оптимизированы для использования на платформах, использующих меченые и немеченые продукты ПЦР (см. следующий раздел). Transgenomic изолировал белок однонитевой нуклеазы и продает его как рекомбинантную форму. Преимущество рекомбинантной формы состоит в том, что, в отличие от смесей ферментов, она не содержит неспецифической нуклеазной активности, которая может разрушать красители на праймерах ПЦР. Недостаток - существенно более высокая стоимость.

Разделение продуктов скола

Первая статья с описанием TILLING использовалась ВЭЖХ для выявления мутаций (McCallum et al., 2000a). Повышение пропускной способности метода за счет использования рестрикционный фермент Cel-I в сочетании с системой на основе геля LICOR для выявления мутаций (Colbert et al., 2001). Преимущества использования этой системы заключаются в том, что сайты мутаций можно легко подтвердить и отличить от шума. Это связано с тем, что для прямой и обратной грунтовки можно использовать красители разного цвета. После того, как продукты расщепления были нанесены на гель, их можно будет просматривать в отдельных каналах, и, как и в случае с RFLP, размеры фрагментов в пределах дорожки в каждом канале должны составлять в сумме размер продукта полной длины. Преимущества системы LICOR заключаются в разделении больших фрагментов (~ 2 КБ), высокой пропускной способности образцов (96 образцов, загруженных на бумажные гребенки) и бесплатном программном обеспечении для выявления мутаций (GelBuddy). Недостатки системы LICOR - необходимость заливки гелей для плит и длительное время работы (~ 4 часа). Методы TILLING и EcoTILLING теперь используются в капиллярных системах от Advanced Analytical Technologies, ABI и Beckman.

Для разделения продуктов ПЦР, не маркированных красителями, можно использовать несколько систем. Простые системы электрофореза в агарозе позволят разделить продукты расщепления недорого и со стандартным лабораторным оборудованием. Это было использовано для обнаружения SNP у кеты и получило название ДЕКОТИЛЛИНГ. Недостатком этой системы является меньшее разрешение по сравнению с полиакриламидными системами. Elchrom Scientific продает гели Spreadex, которые являются сборными, могут иметь высокую пропускную способность и более чувствительны, чем стандартные полиакриламидные гели. Advanced Analytical Technologies Inc. продает флуоресцентную систему AdvanCE FS96 dsDNA, которая представляет собой систему для 96 капиллярного электрофореза, которая имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами; включая возможность разделения больших фрагментов (до 40 КБ), отсутствие необходимости в стадии обессоливания или осаждения, короткое время анализа (~ 30 минут), чувствительность до 5 мкг / мкл и отсутствие необходимости во флуоресцентно меченных праймерах.

Пахотные центры

В мире существует несколько центров обработки почвы, специализирующихся на выращивании сельскохозяйственных культур:

  • Райс - Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
  • Кукуруза - Университет Пердью (США)
  • Brassica napus - Университет Британской Колумбии (Калифорния)
  • Brassica rapa - Центр Джона Иннеса (Великобритания)
  • Арабидопсис - Исследования рака Фреда Хатчинсона
  • Соя - Университет Южного Иллинойса (США)
  • Лотос и Медикаго - Центр Джона Иннеса (Великобритания)
  • Пшеница - Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
  • Горох, помидор - INRA (Франция)
  • Помидор - RTGR, Хайдарабадский университет (Индия)

Рекомендации

  1. ^ Comai, L .; Young, K .; Till, B.J .; Reynolds, S. H .; Greene, E.A .; Codomo, C.A .; Enns, L.C .; Johnson, J. E .; Burtner, C .; Odden, A.R .; Хеникофф, С. (2004). «Эффективное открытие ДНК-полиморфизмов в природных популяциях с помощью Ecotilling». Журнал растений. 37 (5): 778–786. Дои:10.1111 / j.0960-7412.2003.01999.x. PMID  14871304.
  2. ^ Gilchrist, E.J .; Haughn, G.W .; Ying, C.C .; Отто, С. П .; Zhuang, J .; Cheung, D .; Hamberger, B .; Aboutorabi, F .; Калиняк, Т .; Johnson, L.E.E .; Bohlmann, J .; Ellis, B.E .; Douglas, C.J .; Кронк, К. К. Б. (2006). «Использование Ecotilling в качестве эффективного инструмента обнаружения SNP для изучения генетической изменчивости в диких популяциях Populus trichocarpa». Молекулярная экология. 15 (5): 1367–1378. Дои:10.1111 / j.1365-294X.2006.02885.x. PMID  16626459.
  3. ^ Mejlhede, N .; Kyjovska, Z .; Backes, G .; Burhenne, K .; Расмуссен, С.К .; Джахур, А. (2006). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариаций генов устойчивости к мучнистой росе mlo и Mla ячменя» (PDF). Селекция растений. 125 (5): 461–467. Дои:10.1111 / j.1439-0523.2006.01226.x.
  4. ^ Nieto, C .; Пирон, Ф .; Dalmais, M .; Marco, C.F .; Moriones, E .; Gómez-Guillamón, M. L .; Трунигер, В .; Gómez, P .; Гарсия-Мас, Дж .; Аранда, М. А .; Бендахман, А. (2007). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариантов дыни eIF4E, фактора, контролирующего восприимчивость к вирусу». BMC Биология растений. 7: 34. Дои:10.1186/1471-2229-7-34. ЧВК  1914064. PMID  17584936.
  5. ^ Гарвин, М. Р .; Гарретт, А. Дж. (2007). «ДЕКО-ТИЛЛИНГ: недорогой метод обнаружения однонуклеотидного полиморфизма, который снижает систематическую ошибку установления». Заметки о молекулярной экологии. 7 (5): 735–746. Дои:10.1111 / j.1471-8286.2007.01767.x.
  6. ^ Цай, Елена; Хауэлл, Тайсон; Нитчер, Ребекка; Миссириан, Виктор; Уотсон, Брайан; Ngo, Кэти Дж .; Либерман, Мерич; Фасс, Джозеф; Уауи, Кристобаль; Тран, Роберт К .; Хан, Асиф Али; Фильков, Владимир; Tai, Thomas H .; Дубцовский, Хорхе; Комай, Лука (2011). «Открытие редких мутаций в популяциях: TILLING путем секвенирования». Физиология растений. 156 (3): 1257–1268. Дои:10.1104 / стр.110.169748. ЧВК  3135940. PMID  21531898.

Научная литература

внешняя ссылка