Экстракт яиц Xenopus - Xenopus egg extract

Xenopus яичный экстракт представляет собой лизат, который получают путем измельчения яиц Африканская когтистая лягушка Xenopus laevis. Он предлагает мощный бесклеточный (или in vitro) система для изучения различных биологических процессов клетки, в том числе клеточный цикл прогрессия ядерный транспорт, Репликация ДНК и сегрегация хромосом. Его еще называют Xenopus яйцо бесклеточная система или же Xenopus экстракт без яичных клеток.

История

О первом экстракте яиц лягушки сообщили в 1983 году Лока и Масуи.^[1] В этой новаторской работе использовались яйца Леопардовая лягушка Рана пипиенс подготовить выписку. Позже та же процедура была применена к яйцам Xenopus laevis, становясь популярным для изучения развития клеточного цикла и клеточных событий, зависимых от клеточного цикла.^[2] Экстракты, полученные из яиц Японская обыкновенная жаба Bufo japonicus^[3] или из Западная когтистая лягушка Xenopus tropicalis^[4] также поступали сообщения.

Основы приготовления экстракта

В клеточный цикл неоплодотворенных яиц X. laevis очень синхронно задерживается в метафазе мейоза II. На оплодотворение, метафазный арест снимается действием Ca²⁺ ионы, выпущенные из эндоплазматический ретикулум, тем самым инициируя циклы ранних эмбриональных клеток, которые чередуются S фаза (Репликация ДНК ) и M фаза (митоз ).^[5]

Экстракт фазы M

Рис. 1. Яичный экстракт получают путем измельчения. X. laevis яйца центрифугированием

Неоплодотворенные яйца в буфере, содержащем Ca2 + хелатор EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота) упаковываются в центрифужную пробирку. После удаления излишков буфера яйца измельчаются центрифугирование (~ 10,000 г). Растворимая фракция, которая появляется между липидной крышкой и желтком, называется экстрактом М-фазы. Этот экстракт содержит высокий уровень циклин B -Cdk1. Когда демембранованные ядра сперматозоидов инкубируются с этим экстрактом, он претерпевает ряд структурных изменений и в конечном итоге превращается в набор хромосом M фазы с биполярным шпиндели.

Межфазный (S-фаза) экстракт

Различные виды яичных экстрактов

Велосипедный экстракт

Рисунок 2. Интерфазное ядро ​​(слева) и кластер митотических хромосом (справа), полученные в циклическом экстракте. Пруток, 10 мкм.

Высокоскоростной супернатант (HSS)

Нуклеоплазматический экстракт (NPE)

Открытия, сделанные с использованием яичных экстрактов

• Очистка фактора промотирования М-фазы (MPF)^[6]
• Выяснение роли синтеза и деградации циклин B в развитии клеточного цикла^[7][8]
• Открытие того, что расщепление белков, кроме циклин B необходим для инициации сегрегации хромосом^[9]
• Открытие механизма шпиндель сборка, которая зависит от хроматин, но не центросомы^[10]
• Предложение о Репликация ДНК система лицензирования^[11] и определение ответственных фактор^[12]
• Идентификация импортин α / β отвечает за ядерный транспорт^[13]
• Открытие конденсин комплекс, необходимый для сборки митотических хромосом^[14][15]
• Идентификация когезин комплекс необходим для сцепление сестринских хроматид^[16]

Совсем недавно яичные экстракты были использованы для изучения перепрограммирования дифференцированных ядер,^[17] физические свойства шпинделей^[18] и ядра^[19], и теоретическое понимание контроля клеточного цикла.^[20]

Смотрите также

• Ёсио Масуи
• клеточный цикл
• Cdk1
• циклин
• Репликация ДНК
• ядерный транспорт
• шпиндельный аппарат
• конденсин
• когезин

Рекомендации

1. Лока MJ, Masui Y (1983). «Формирование in vitro пронуклеусов сперматозоидов и митотических хромосом, индуцированных компонентами ооплазмы амфибий». Наука. 220: 719–721. PMID  6601299.
2. Лока MJ, Маллер JL. (1985). «Индукция разрушения ядерной оболочки, конденсации хромосом и образования веретена в бесклеточных экстрактах». J. Cell Biol. 101: 518–523. PMID  3926780.
3. Осуми К., Катагири С. (1991). «Характеристика ооплазматического фактора, вызывающего деконденсацию и удаление протамина из ядер сперматозоидов жаб: участие нуклеоплазмина». Dev. Биол. 148: 295–305. PMID  1936566.
4. Brown KS, Blower MD, Maresca TJ, Grammer TC, Harland RM, Heald R (2007). «Экстракты яиц Xenopus tropicalis дают представление о масштабировании митотического веретена». J. Cell Biol. 176: 765–770. PMID  17339377.
5. Масуи Y (2000). «Неуловимый цитостатический фактор в яйце животного». Nat. Преподобный Мол. Cell Biol. 1: 228–232. PMID  11252899.
6. Лока MJ, Hayes MK, Maller JL (1988). «Очистка фактора, способствующего созреванию, внутриклеточного регулятора ранних митотических событий». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 85: 3009–3013. PMID  3283736.
7. Мюррей А.В., Киршнер М.В. (1989). «Синтез циклина запускает цикл ранних эмбриональных клеток». Природа. 339: 275–280. PMID  2566917.
8. Мюррей А.В., Соломон М.Дж., Киршнер М.В. (1989). «Роль синтеза и деградации циклина в контроле активности фактора, способствующего созреванию». Природа. 339: 280–286. PMID  2566918.
9. Холлоуэй С.Л., Глотцер М., Кинг Р.В., Мюррей А.В. (1993). «Анафаза инициируется протеолизом, а не инактивацией фактора, способствующего созреванию». Клетка. 73: 1393–1402. PMID  8391932.
10. Heald R, Tournebize R, Blank T, Sandaltzopoulos R, Becker P, Hyman A, Karsenti E (1996). «Самоорганизация микротрубочек в биполярные веретена вокруг искусственных хромосом в экстрактах яиц Xenopus». Природа. 382: 420–425. PMID  8684481.
11. Блоу Дж. Дж., Ласки Р. А. (1988). «Роль ядерной оболочки в контроле репликации ДНК в клеточном цикле». Природа. 332: 546–548. PMID  3357511.
12. Кубота Ю., Мимура С., Нисимото С., Такисава Н., Нодзима Н. (1995). «Идентификация дрожжевого белка MCM3 в качестве компонента лицензирующего фактора репликации ДНК Xenopus». Клетка. 81: 601–609. PMID  7758114.
13. Гёрлих Д., Прен С., Ласки Р.А., Хартманн Э. (1994). «Выделение белка, необходимого для первого шага импорта ядерного белка». Клетка. 79: 767–778. PMID  8001116.
14. Хирано Т., Митчисон Т.Дж. (1994). «Гетеродимерный белок спиральной спирали, необходимый для конденсации митотических хромосом in vitro». Клетка. 79: 449–458. PMID  7954811.
15. Хирано Т., Кобаяши Р., Хирано М. (1997). «Конденсины, комплексы белков конденсации хромосом, содержащие XCAP-C, XCAP-E и гомолог Xenopus белка Drosophila Barren». Клетка. 89: 511–521. PMID  9160743.
16. Лосада А., Хирано М., Хирано Т. (1998). «Идентификация белковых комплексов Xenopus SMC, необходимых для сцепления сестринских хроматид». Genes Dev. 12 (13): 1986–1997. PMID  9649503.
17. Ganier O, Bocquet S, Peiffer I, Brochard V, Arnaud P, Puy A, Jouneau A, Feil R, Renard JP, Méchali M (2011). «Синергическое перепрограммирование клеток млекопитающих путем комбинированного воздействия митотических экстрактов яиц Xenopus и факторов транскрипции». Proc Natl Acad Sci USA. 108: 17331–17336. PMID  21908712.
18. Симамото Ю., Маеда Ю. Т., Ишивата С., Либчабер А. Дж., Капур TM (2011). «Понимание микромеханических свойств метафазного веретена». Клетка. 145: 767–778. PMID  21703450.
19. Хара Й, Мертен Калифорния (2015). «Накопление мембран на основе динеина регулирует расширение ядер в экстрактах яиц Xenopus laevis». Dev Cell. 33: 562–575. PMID  26004509.
20. Помереннинг JR, Ким SY, Феррелл JE младший (2005). «Рассечение осциллятора клеточного цикла на системном уровне: обход положительной обратной связи производит затухающие колебания». Клетка. 122: 565–578. PMID  16122424.