Цианин - Cyanine

Цианины определяются как «синтетические красители с общей формулой R2N [CH = CH] nCH = N + R2↔R2N + = CH [CH = CH] nNR2 (n - небольшое число), в которых обычно образуются азот и часть сопряженной цепи часть гетероциклической системы, такой как имидазол, пиридин, пиррол, хинолин и тиазол ».[1] Цианины используются в промышленной биотехнологии (маркировка, анализ, биомедицинская визуализация).

Структура

Цианины:
I = стрептоцианины,
II = гемицианины,
III = закрытые цианины

Цианины классифицируются по разным причинам:[2]

  • Стрептоцианины или же цианины с открытой цепью:
р2N+= CH [CH = CH]п-NR2 (Я)
  • Гемицианины:
Арил = N+= CH [CH = CH]п-NR2 (II)
  • Цианины с закрытой цепью:
Арил = N+= CH [CH = CH]п-N = Арил (III)

Дополнительно признаются эти классы:[3]

  • Нейтроцианины:
р2N+= CH [CH = CH]п-CN и R2N+= CH [CH = CH]п-CHO
  • Апоцианины

где два четвертичных азот присоединились полиметин цепь.[4] Оба атома азота могут независимо входить в состав гетероароматический часть, Такие как пиррол, имидазол, тиазол, пиридин, хинолин, индол, бензотиазол, так далее.

История и использование в промышленности

Цианины были впервые синтезированы более века назад. Первоначально они использовались и используются для увеличения диапазона чувствительности фотографические эмульсии, т.е. для увеличения диапазона длины волн который будет формировать изображение на пленке, делая фильм панхроматический.[3] Цианины также используются в CD-R и DVD-R средства массовой информации. Используемые в основном зеленые или голубые по цвету и химически нестабильны. По этой причине нестабилизированные цианиновые диски не подходят для архивных CD и DVD. Последние цианиновые диски содержат стабилизаторы, которые значительно замедляют износ. Эти диски часто рассчитаны на срок хранения в архиве 75 лет и более. Другие красители, используемые в CD-R: фталоцианин и азо.

Использование в биотехнологии

Для применения в биотехнологии специальные цианиновые красители синтезируются из 2, 3, 5 или 7 -метиновых структур с реактивными группами на одном или обоих концах азота, так что они могут быть химически связаны с любым из них. нуклеиновые кислоты или же белок молекулы. Маркировка выполняется для целей визуализации и количественной оценки. Биологические приложения включают сравнительная геномная гибридизация и генные чипы, которые используются в транскриптомика, и различные исследования в протеомика такие как локализация РНК,[5] исследования молекулярного взаимодействия путем переноса энергии флуоресценции (FRET ) и флуоресцентный иммуноанализ.

Цианиновые красители доступны с различными модификациями, такими как метильные, этильные или бутильные заместители, карбоксильные, ацетилметокси и сульфогруппы, которые изменяют их гидрофильность.[6]

ЗондEx (нм)Em (нм)МВтКвантовый выход
Cy2489506714QY 0,12
Cy3(512);550570;(615)767QY 0,15 [7]*
Cy3B558572;(620)658QY 0,67
Cy3.5581594;(640)1102QY 0,15
Cy5(625);650670792QY 0,27[7]
Cy5.56756941128QY 0,28[8]
Cy7743767818QY 0,28

Ex (нм): длина волны возбуждения в нанометры
Em (нм): длина волны излучения в нанометры
МВт: Молекулярный вес
QY: Квантовый выход

* Сильно зависит от вязкости, температуры и биомолекулярных взаимодействий. [9]

Общие цианиновые красители и их применение

Поскольку они дают более яркую и стабильную флуоресценцию, цианины могут успешно заменять обычные красители, такие как флуоресцеин и родамины.

  • Cy3 и Cy5 являются наиболее популярными, обычно используются в сочетании для обнаружения двух цветов.
Cy3 Cy5 dyes.gif

Cy3 флуоресценция зеленовато-желтая (~ 550 нм возбуждение, эмиссия ~ 570 нм), а Cy5 флуоресцентный в красной области (возбуждение ~ 650, эмиссия 670 нм).[10] Cy3 может быть обнаружен различными флуорометрами, тепловизорами и микроскопами со стандартными фильтрами для тетраметилродамина (TRITC). Из-за высокого молярный коэффициент экстинкции, этот краситель также легко обнаруживается невооруженным глазом на гели для электрофореза, и в растворе. Cy5 стал популярной заменой далеким красным флуоресцентным красителям из-за его высокого коэффициента экстинкции (всего 1 наномоль можно обнаружить при гель-электрофорезе невооруженным глазом) и его максимума эмиссии флуорофора в красной области, где многие Детекторы CCD имеют максимальную чувствительность, а биологические объекты дают низкие фоновые помехи.

Сканеры действительно используют разные лазер длины волн излучения (обычно 532 нм и 635 нм ) и длины волн фильтра (550-600 нм и 655-695 нм ), чтобы избежать фонового загрязнения. Таким образом, они могут легко отличать цвета от Cy3 и от Cy5, а также могут количественно определять количество меток Cy3 и Cy5 в одном образце (многопараметрическое обнаружение).

  • Пригодятся и другие цианиновые красители:

Cy3.5 может заменить сульфорамин 101.

Cy5.5 представляет собой краситель, излучающий флуоресценцию в ближней инфракрасной области (ИК) (максимум возбуждения / испускания 678/694 нм).

Cy7 представляет собой флюор ближнего ИК-диапазона, невидимый невооруженным глазом (максимум возбуждения / излучения 750/776 нм). Он используется в in vivo приложения для обработки изображений, а также краситель Cy7.5.

Sulfo–Цианиновые красители содержат одну или две сульфогруппы, что делает краситель Cy водорастворимым, но доступны три- и квадрисульфированные формы для еще большей растворимости в воде.[6] Пегилирование представляет собой другую модификацию, которая придает гидрофильность не только красителю, но и меченному конъюгату.

Номенклатура и структура

Номенклатура Cy3 и Cy5 была впервые предложена Ernst et al.[4] в 1989 году и является нестандартным, поскольку не дает намеков на их химическое строение. В исходной статье цифра обозначала количество метины (как показано), а боковые цепи не указаны. Из-за этой неоднозначности различные структуры в литературе обозначаются как Cy3 и Cy5. В R группы не обязательно должны быть идентичными. В используемых красителях они короткие алифатический цепи, одна или обе из которых заканчиваются высоко реактивным часть Такие как N-гидроксисукцинимид или же малеимид.

Альтернативы

Разработано множество аналогов стандартных красителей Cy 2/3 / 3,5 / 5 / 5,5 / 7 / 7,5 с использованием разнообразных модификаций: Красители Alexa Fluor, Dylight, Красители FluoProbes, Красители Sulfo Cy,[11] Сетчатые красители,[12] Красители IRIS от Cyanine Technologies [13] и другие могут использоваться взаимозаменяемо с красителями Cy в большинстве биохимических применений, с заявленными улучшениями растворимости, флуоресценции или фотостабильности.[14][15]

Хотя патентная защита стандартной серии красителей Cy истекла, название Cy остается в силе. Следовательно, теперь продаются красители, которые идентичны красителям Cy, но имеют разные названия.

Приложения

А цианобактерии окрашенный в зеленый цвет с цианиновым красителем

Цианиновые красители используются для маркировки белков, антител, пептидов, зондов нуклеиновых кислот и любых других биомолекул для использования в различных методах обнаружения флуоресценции: Проточной цитометрии, Микроскопия (в основном видимый диапазон, но также УФ, ИК ), Микропланшетные анализы, Микрочипы, а также «светящиеся зонды» и визуализация in vivo.[16]</ref>

Маркировка нуклеиновых кислот

В микрочип эксперименты ДНК или же РНК мечен либо Cy3, либо Cy5, который был синтезирован, чтобы нести N-гидроксисукцинимидиловый эфир (NHS -эфир) реактивная группа. Поскольку эфиры NHS легко реагируют только с алифатический амин группы, отсутствующие в нуклеиновых кислотах, нуклеотиды должны быть изменены с помощью аминоаллил группы. Это достигается путем включения аминоаллил-модифицированных нуклеотидов во время реакций синтеза. Хорошее соотношение - метка каждые 60 оснований, чтобы метки не были слишком близко друг к другу, что привело бы к закалка последствия.

Маркировка белков

Для маркировки белков красители Cy3 и Cy5 иногда несут сукцинимидил группа для реакции с аминами, или малеимид группа реагировать с сульфгидрил группа цистеин остатки.

Cy5 чувствителен к своему электронному окружению. Изменения в конформации белка, к которому он прикреплен, приведет либо к усилению, либо к подавлению излучения. Скорость этого изменения может быть измерена для определения кинетических параметров фермента. Красители могут использоваться для аналогичных целей в FRET эксперименты.

Cy3 и Cy5 используются в протеомика эксперименты, так что образцы из двух источников могут быть смешаны и обработаны вместе в процессе разделения.[17][18] Это исключает вариации из-за различных экспериментальных условий, которые неизбежны, если образцы обрабатывались отдельно. Эти вариации делают чрезвычайно трудным, если не невозможным, использование компьютеров для автоматизации сбора данных после завершения разделения. Использование этих красителей упрощает автоматизацию.

Этимология

Слово цианин происходит от английского слова «голубой», что условно означает оттенок цвет морской волны (близко к "aqua") и происходит от Греческий κυάνεος/κυανοῦς кянеос / кианус что означает несколько другой цвет: «темно-синий».

Рекомендации

  1. ^ «Цианиновые красители».
  2. ^ Ким, Ынха; Пак, Сын Бом (2010). «Открытие новых синтетических красителей: целевой синтез или комбинаторный подход?». В Демченко, Александр П. (ред.). Продвинутые репортеры флуоресценции в химии и биологии I: основы и молекулярный дизайн, том 8 серии Springer по флуоресценции. Берлин: Springer. п. 172. ISBN  9783642047022.
  3. ^ а б Бернет, Хорст (2008). «Метиновые красители и пигменты». Энциклопедия промышленной химии Ульмана. Вайнхайм: Wiley-VCH. Дои:10.1002 / 14356007.a16_487.pub2.
  4. ^ а б Эрнст Л.А., Гупта Р.К., Муджумдар Р.Б., Ваггонер А.С. (январь 1989 г.). «Реагенты для маркировки цианиновых красителей для сульфгидрильных групп». Цитометрия. 10 (1): 3–10. Дои:10.1002 / cyto.990100103. PMID  2917472.
  5. ^ Blower MD, Feric E, Weis K, Heald R (декабрь 2007 г.). «Полногеномный анализ демонстрирует консервативную локализацию информационных РНК в митотических микротрубочках». Журнал клеточной биологии. 179 (7): 1365–73. Дои:10.1083 / jcb.200705163. ЧВК  2373496. PMID  18166649.
  6. ^ а б Цианин красители
  7. ^ а б Муджумдар Б., Эрнст А., Муджумдар С. Р., Льюис С. Дж., Вагонер А. С. (март 1993 г.). «Реагенты для маркировки цианиновых красителей: сульфоиндоцианинсукцинимидиловые эфиры». Биоконъюгат Химия. 4 (2): 105–111. Дои:10.1021 / bc00020a001. PMID  7873641.
  8. ^ Умедзава К., Мацуи А., Накамура Ю., Читтерио Д., Сузуки К. (2009). «Яркие флуоресцентные красители с регулируемой цветовой гаммой в области Vis / NIR: создание новых многоцветных флуорофоров на основе бордипиррометена». Химия. 15 (5): 1096–106. Дои:10.1002 / chem.200801906. PMID  19117043.
  9. ^ Левит, Марсия; Ранджит, Суман (2011). «Цианиновые красители в биофизических исследованиях: фотофизика полиметиновых флуоресцентных красителей в биомолекулярных средах». Ежеквартальные обзоры биофизики. 44 (1): 123–151. Дои:10.1017 / S0033583510000247. ISSN  1469-8994. PMID  21108866.
  10. ^ Jackson ImmunoResearch. «Цианиновые красители (Cy2, Cy3 и Cy5)». Получено 2008-10-31.
  11. ^ "Сиандие, ООО". Архивировано из оригинал на 2018-10-03. Получено 2013-11-01.
  12. ^ SETA BioMedicals
  13. ^ «Архивная копия». Архивировано из оригинал на 2015-01-26. Получено 2015-01-26.CS1 maint: заархивированная копия как заголовок (связь)
  14. ^ FluoProbes488 по сравнению с FITC, Cyanine2
  15. ^ Сравнение FluoProbes547H в конфокальной микроскопии
  16. ^ Армитаж, Брюс А. (27 января 2005 г.). «Взаимодействие цианинового красителя с ДНК: интеркаляция, связывание канавок и агрегация». Связующие ДНК и связанные предметы. Темы современной химии. 253. С. 55–76. Дои:10.1007 / b100442. ISBN  978-3-540-22835-6.
  17. ^ Unlü M, Morgan ME, Minden JS (октябрь 1997 г.). «Различный гель-электрофорез: метод одного геля для обнаружения изменений белковых экстрактов». Электрофорез. 18 (11): 2071–7. Дои:10.1002 / elps.1150181133. PMID  9420172. S2CID  604007.
  18. ^ Остерман И.А., Устинов А.В., Евдокимов Д.В., Коршун В.А., Сергиев П.В., Серебрякова М.В., Демина И.А., Галямина М.А., Говорун В.М., Донцова О.А. (янв 2013). «Новое исследование протеома, сочетающее химию щелчков и 2DE» (PDF). Протеомика. 13 (1): 17–21. Дои:10.1002 / pmic.201200393. PMID  23161590. Архивировано из оригинал (PDF) на 2015-06-30. Получено 2015-06-27.

внешняя ссылка