Флуоресцентный тег - Fluorescent tag

С. cerevisiae септины, выявленные с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентного мечения

В молекулярная биология и биотехнология, а флуоресцентный тег, также известный как флуоресцентная метка или же флуоресцентный зонд, это молекула который присоединен химически, чтобы помочь в обнаружении биомолекула такой как белок, антитело или аминокислота. В общем, флуоресцентный маркировка или маркировка использует реактивное производное флуоресцентной молекулы, известное как флуорофор. Флуорофор селективно связывается с определенной областью или функциональной группой на молекуле-мишени и может быть присоединен химически или биологически.[1] Различные методы маркировки, такие как ферментативная маркировка, маркировка белков, и генетическая маркировка широко используются. Этидиум бромид, флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок общие теги. Наиболее часто меченые молекулы - это антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения конкретной мишени.[2]

История

Стоукс Джордж Дж.
Осаму Шимомура-пресс-конференция 6 декабря 2008-1

Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентной маркировки радиоизотопы были использованы для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, включающие использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средства для мечения и идентификации биомолекул.[3] Хотя флуоресцентное мечение в этом отношении использовалось только недавно, открытие флуоресценции происходит гораздо дольше.

Сэр Джордж Стоукс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, согласно которому длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Ричард Мейер тогда назвал флуорофор в 1897 г. для описания химической группы, связанной с флуоресценцией. С того времени, Флуоресцеин был создан как флуоресцентный краситель Адольфом фон Байером в 1871 году, и метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентная микроскопия в 1911 г.[4]

Бромид этидия и его варианты были разработаны в 1950-х годах.[4] а в 1994 году были введены флуоресцентные белки или FP.[5] Зеленый флуоресцентный белок или GFP был обнаружен Осаму Шимомура в 1960-х годах и был разработан как индикаторная молекула Дугласом Прашером в 1987 году.[6] FP привели к прорыву живых визуализация клеток с возможностью выборочно маркировать участки генетического белка и наблюдать функции и механизмы белка.[5] За этот прорыв Шимомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году.[7]

Были разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалы, и электрохимические сенсоры. Флуоресцентная маркировка также является распространенным методом, в котором области применения расширились до ферментативной маркировки, химической маркировки, маркировка белков и генетическая маркировка.[1]

Типы биосенсоров

Методы отслеживания биомолекул

В настоящее время существует несколько методов маркировки для отслеживания биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.

Изотопные маркеры

Обычные виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода включаются в полипептидные последовательности.[8] Затем эти полипептиды проходят через масс-спектрометрии. Благодаря точно определенному изменению, которое эти изотопы вызывают в пептидах, по графику спектрометрии можно определить, какие пептиды содержат изотопы. Таким образом можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль в качестве фотохромов, описанных ниже.

Колориметрические биосенсоры

Биосенсоры прикрепляются к интересующему веществу. Обычно это вещество не может поглощать свет, но с подключенным биосенсором свет может поглощаться и излучаться спектрофотометр.[9] Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также могут изменять цвет в изменяющейся среде (например, с синего на красный). Исследователь сможет исследовать и получать данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она может видеть визуально у гибридных видов биосенсора и молекулы.[10]

Колориметрические анализы обычно используются для определения того, какова концентрация одного вида по сравнению с другим.[9]

Фотохромные соединения

Фотохромный составы имеют возможность переключаться между диапазоном или множеством цветов. Их способность отображать разные цвета зависит от того, как они поглощают свет. Различные изомерные проявления молекулы поглощают свет с разной длиной волны, так что каждый изомерный вид может отображать свой цвет в зависимости от своего поглощения. К ним относятся соединения с фотопереключением, которые представляют собой белки, которые могут переключаться из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное в определенных условиях.[11]

Наиболее распространенной органической молекулой, используемой в качестве фотохрома, является дневник.[12] Другие примеры фотосопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые можно использовать как в клетках растений, так и в клетках млекопитающих, чтобы наблюдать, как клетки перемещаются в различные среды.[11]

Биоматериалы

Флуоресцентные биоматериалы - это возможный способ использования внешних факторов для более заметного наблюдения за ходом пути. Метод включает флуоресцентную метку пептидных молекул, которые могут изменить естественный путь организма. Когда этот пептид вводится в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем наглядно увидеть результат лечения.[13]

Электрохимические датчики

Электрохимические датчики могут использоваться для определения биомолекул без маркировки. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между исследуемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем к электроду прикладывается известный потенциал из тока обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, один метод с использованием электрохимического зондирования включает медленное повышение напряжения, вызывающее окисление или восстановление химических веществ на электроде. График зависимости тока ячейки от напряжения позволяет в конечном итоге определить количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде.[14] Флуоресцентные метки могут использоваться вместе с электрохимическими датчиками для облегчения обнаружения в биологической системе.

Флуоресцентные этикетки

Aequorea victoria
Структура GFP

Из различных методов мечения биомолекул флуоресцентные метки имеют преимущество в том, что они очень чувствительны даже при низкой концентрации и не разрушают складывание и функцию молекулы-мишени.[1]

Зеленый флуоресцентный белок это встречающийся в природе флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria это широко используется для маркировки интересующих белков. GFP излучает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении за счет поглощения света. В хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser ^ 65-Tyr ^ 66-Gly ^ 67, расположенного внутри β-барреля. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был изменен путем изменения длины волны поглощаемого света для включения других цветов флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок, BFP или синий флуоресцентный белок, и CFP или голубой флуоресцентный белок являются примерами вариантов GFP. Эти варианты получены с помощью генной инженерии гена GFP.[15]

Синтетические флуоресцентные зонды также можно использовать в качестве флуоресцентных меток. Преимущества этих этикеток включают меньший размер и большее разнообразие цветов. Их можно использовать для более селективной маркировки представляющих интерес белков с помощью различных методов, включая маркировку на основе химического распознавания, такую ​​как использование хелатирующих металлы пептидных меток и маркировку на основе биологического распознавания с использованием ферментативных реакций.[16] Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и излучения, а также лучшую стабильность, синтетические зонды имеют тенденцию быть токсичными для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях визуализации клеток.[1]

Флуоресцентные метки можно гибридизировать с мРНК, чтобы помочь визуализировать взаимодействие и активность, например локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, меченная флуоресцентным зондом, присоединяется к одной цепи мРНК, и затем ее можно рассматривать во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки.[17]

Флуорогенные этикетки

Флуороген - это лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но когда он связан определенным белком или структурой РНК, становится флуоресцентным.[18]

Например, БЫСТРЫЙ это вариант фотоактивный желтый белок который был разработан, чтобы связывать химические имитаторы трипептидного хромофора GFP.[19]Точно так же аптамер шпината представляет собой сконструированную последовательность РНК, которая может связываться с химическими имитаторами хромофора GFP, обеспечивая тем самым условную и обратимую флуоресценцию молекулам РНК, содержащим последовательность.[20]

Использование меток в флуоресцентной маркировке

В прямом тесте на флуоресцентные антитела антитела были химически связаны с флуоресцентным красителем.
FISH-изображение бифидобактерий Cy3
FISH анализ синдром ди Джорджа

Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей природой и высокой чувствительностью. Это сделало его одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул.[1] В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентного мечения.

Ферментативная маркировка

При ферментативной маркировке сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка.[21] После транскрипции образуется гибрид РНК + флуоресцентный. Интересующий объект прикреплен к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используется флуоресцеин или биотин.

Химическая маркировка

Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и определенной генетической аминокислотной последовательностью.[22] Химическая маркировка иногда используется в качестве альтернативы GFP. Синтетические белки, которые функционируют как флуоресцентные зонды, меньше, чем у GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более разнообразных ситуациях. Кроме того, они предлагают более широкий диапазон цветов и фотохимических свойств.[23] В связи с недавними достижениями в области химической маркировки химические метки предпочтительнее флуоресцентных белков из-за архитектурных и размерных ограничений характерного β-цилиндра флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств.[22]

Маркировка белков

При маркировке белков используется короткий тег, чтобы свести к минимуму нарушение сворачивания и функции белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфическими мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты внутри белка. Примеры тегов, используемых для маркировки белков, включают теги биомышьяка, теги гистидина и теги FLAG.[1]

Генетическая маркировка

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), является примером метода генетической маркировки, в котором используются зонды, специфичные для хромосомных участков по длине хромосомы, также известные как хромосомная окраска. Множественные флуоресцентные красители, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и излучения, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаруживать присутствующие красители и отправлять их на компьютер, который может выявить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявить такие аномалии, как делеции и дупликации.[24]

Клеточная визуализация

Химические метки больше подходят для технологий визуализации, чем флуоресцентные белки, поскольку химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к целевым белкам.[25] Затем белки могут быть помечены и обнаружены с помощью изображений, таких как микроскопия сверхвысокого разрешения, Ca2+-изображение, определение pH, обнаружение перекиси водорода, световая инактивация с помощью хромофора и многофотонная световая микроскопия. В естественных условиях визуализирующие исследования на живых животных были впервые выполнены с использованием мономерный белок, полученный из бактериальной галогеналкандегалогеназы, известной как Halo-tag.[22][26] Гало-тег ковалентно ссылки на его лиганд и позволяет лучше экспрессировать растворимые белки.[26]

Преимущества

Хотя флуоресцентные красители могут не иметь такой же чувствительности, как радиоактивные зонды, они способны в реальном времени показывать активность молекул в действии.[27] Более того, радиация и надлежащее обращение больше не вызывают беспокойства.

С развитием флуоресцентного мечения, флуоресцентная микроскопия позволил визуализировать специфические белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация определенных белков привела к появлению важных концепций в клеточной биологии, таких как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. При визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать перемещения белков и их взаимодействия.[24]

Последние достижения в методах использования флуоресцентных меток привели к визуализации мРНК и его локализация в различных организмах. Визуализация РНК в живых клетках может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, которая химически связана с флуоресцентной меткой, в живые клетки с помощью микроинъекции. Этот метод использовался, чтобы показать, как Оскар мРНК в Дрозофила эмбрион локализуется в задний регион ооцит.[28]

Смотрите также

Примечания

  1. ^ а б c d е ж Саху, Харекрушна (1 января 2012 г.). «Методы флуоресцентного мечения в биомолекулах: воспоминание». RSC Advances. 2 (18): 7017–7029. Дои:10.1039 / C2RA20389H.
  2. ^ «Флуоресцентное мечение биомолекул с помощью органических зондов - Презентации - PharmaXChange.info». 29 января 2011 г.
  3. ^ Гвинн и Пейдж, Питер и Гай. «Тенденции лабораторных технологий: флуоресценция + этикетирование». Наука. Получено 10 марта 2013.
  4. ^ а б Кричка Л.Дж., Фортина П. (апрель 2009 г.). «Аналитическое происхождение:« первые »в флуоресцентной маркировке нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот». Клиническая химия. 55 (4): 670–83. Дои:10.1373 / Clinchem.2008.116152. PMID  19233914.
  5. ^ а б Цзин С., корнуоллский VW (сентябрь 2011 г.). «Химические метки для маркировки белков внутри живых клеток». Отчеты о химических исследованиях. 44 (9): 784–92. Дои:10.1021 / ar200099f. ЧВК  3232020. PMID  21879706.
  6. ^ «Зеленый флуоресцентный белок - История GFP - Осаму Шимомура».
  7. ^ Шимомура, Осаму. «Нобелевская премия по химии». Получено 5 апреля 2013.
  8. ^ Чен X, Смит Л.М., Брэдбери Е.М. (март 2000 г.). «Сайт-специфическая массовая маркировка стабильными изотопами в белках для точной и эффективной идентификации белков». Аналитическая химия. 72 (6): 1134–43. Дои:10.1021 / ac9911600. PMID  10740850.
  9. ^ а б «Колориметрические анализы». Получено 3 апреля 2013.
  10. ^ Halevy, Revital; София Колушеваль; Роберт Э.В. Хэнкок; Раз Елинек (2002). «Колориметрические биосенсорные везикулы для биотехнологических применений» (PDF). Материалы симпозиума Общества исследования материалов. 724. Биологические и биомиметические материалы. От свойств к функции.. Получено 4 апреля 2013.
  11. ^ а б Lummer M, Humpert F, Wiedenlübbert M, Sauer M, Schüttpelz M, Staiger D (сентябрь 2013 г.). «Новый набор обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для использования в трансгенных растениях». Молекулярный завод. 6 (5): 1518–30. Дои:10.1093 / mp / sst040. PMID  23434876.
  12. ^ Перье А., Морель Ф, Жакмен Д. (август 2012 г.). «Мультифотохромизм одиночных молекул с диарилэтенами». Отчеты о химических исследованиях. 45 (8): 1173–82. Дои:10.1021 / ar200214k. PMID  22668009.
  13. ^ Чжан И, Ян Дж (январь 2013 г.). «Стратегии проектирования флуоресцентных биоразлагаемых полимерных биоматериалов». Журнал химии материалов B. 1 (2): 132–148. Дои:10.1039 / C2TB00071G. ЧВК  3660738. PMID  23710326.
  14. ^ "bioee.ee.columbia.edu" (PDF). Архивировано из оригинал (PDF) на 2012-12-20.
  15. ^ Кокс, Майкл; Нельсон, Дэвид Р .; Ленингер, Альберт Л (2008). Принципы биохимии Ленингера. Сан-Франциско: W.H. Фримен. ISBN  978-0-7167-7108-1.
  16. ^ Чон Д., Мин К., Чон Дж, Чан В., Квон И (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы. 9 (5): 862–72. Дои:10.1039 / c2mb25422k. PMID  23318293.
  17. ^ Вейл Т.Т., Партон Р.М., Дэвис I (июль 2010 г.). «Сделать сообщение ясным: визуализация локализации мРНК». Тенденции в клеточной биологии. 20 (7): 380–90. Дои:10.1016 / j.tcb.2010.03.006. ЧВК  2902723. PMID  20444605.
  18. ^ Сент-Дьёрджи К., Шмидт Б.Ф., Шмидт Б.А., Кригер Й., Фишер Г.В., Закель К.Л., Адлер С., Фицпатрик Дж. А., Вулфорд Калифорния, Ян К., Васильев К. В., Бергет ПБ, Бручез депутат, Джарвик Дж. У., Вагонер А. (февраль 2008 г.) . «Флуороген-активирующие одноцепочечные антитела для визуализации белков клеточной поверхности». Природа Биотехнологии (Абстрактный). 26 (2): 235–40. Дои:10.1038 / nbt1368. PMID  18157118. Мы сообщаем здесь о разработке белков-репортеров, которые генерируют флуоресценцию из темных молекул (флуорогенов).
  19. ^ Пламон М.А., Биллон-Дени Э., Маурин С., Гаурон С., Пимента Ф.М., Шпехт К.Г., Ши Дж., Керард Дж., Пан Б., Россиньол Дж., Монкок К., Морелле Н., Волович М., Лескоп Э, Чен Ю., Триллер А., Вриз С., Ле Со Т., Жюльен Л., Готье А. (январь 2016 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 113 (3): 497–502. Bibcode:2016ПНАС..113..497П. Дои:10.1073 / pnas.1513094113. ЧВК  4725535. PMID  26711992.
  20. ^ Пейдж Дж.С., Ву К.Ю., Яффри С.Р. (июль 2011 г.). «РНК, имитирующая зеленый флуоресцентный белок». Наука. 333 (6042): 642–6. Bibcode:2011Научный ... 333..642P. Дои:10.1126 / science.1207339. ЧВК  3314379. PMID  21798953.
  21. ^ Рихтер А., Швагер С., Хентце С., Ансорге В., Хентце М. В., Мукенталер М. (сентябрь 2002 г.). «Сравнение методов маркировки ДНК флуоресцентными метками, используемых для анализа экспрессии с помощью ДНК-микрочипов» (PDF). Биотехнологии. 33 (3): 620–8, 630. Дои:10.2144 / 02333rr05. PMID  12238772.
  22. ^ а б c Вомбахер Р., Корнуолл VW (июнь 2011 г.). «Химические метки: применение в визуализации флуоресценции живых клеток». Журнал биофотоники. 4 (6): 391–402. Дои:10.1002 / jbio.201100018. PMID  21567974.
  23. ^ Юнг Д., Мин К., Юнг Дж, Джанг В., Квон И (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы. 9 (5): 862–72. Дои:10.1039 / C2MB25422K. PMID  23318293.
  24. ^ а б Мэтью П. Скотт; Лодиш, Харви Ф .; Арнольд Берк; Кайзер, Крис; Монти Кригер; Энтони Бретчер; Хидде Плоег; Анжелика Амон (2012). Молекулярная клеточная биология. Сан-Франциско: В. Х. Фриман. ISBN  978-1-4292-3413-9.
  25. ^ Эттингер, А (2014). «Флуоресцентная визуализация живых клеток». Методы клеточной биологии. 123: 77–94. Дои:10.1016 / B978-0-12-420138-5.00005-7. ISBN  9780124201385. ЧВК  4198327. PMID  24974023.
  26. ^ а б Н. Петерсон С., Квон К. (2012). «HaloTag: улучшение экспрессии растворимости и применение в функциональном анализе белков». Современная химическая геномика. 6 (1): 8–17. Дои:10.2174/1875397301206010008. ЧВК  3480702. PMID  23115610.
  27. ^ Праудников Д., Мирзабеков А. (ноябрь 1996 г.). «Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК». Исследования нуклеиновых кислот. 24 (22): 4535–42. Дои:10.1093 / nar / 24.22.4535. ЧВК  146275. PMID  8948646.
  28. ^ Вейл Т.Т., Партон Р.М., Дэвис I (июль 2010 г.). «Сделать сообщение ясным: визуализация локализации мРНК». Тенденции в клеточной биологии. 20 (7): 380–90. Дои:10.1016 / j.tcb.2010.03.006. ЧВК  2902723. PMID  20444605.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Флуоресцентная спектроскопия